Biology

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

Published: October 16, 2009 doi: 10.3791/1373

Tanja M. Liebig¹, Anne Fiedler¹, Shahram Zoghi¹, Alexander Shimabukuro-Vornhagen¹, Michael S. von Bergwelt-Baildon¹

¹Laboratory for Tumor and Transplantation Immunology and Stem Cell Transplantation Program, University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine

Summary

בסרט זה אנו מציגים את

Abstract

CD40 המופעל בתאי B (CD40-B תאים) זוהו כמקור חלופי חיסונית של גירוי התאים המציגים אנטיגנים (APC) עבור חיסוני סרטן ^1-3. לעומת תאים דנדריטים (DCS), APC מאופיין הטובה ביותר, תאים CD40-B יש מספר מאפיינים ביולוגיים טכני מובהק. בדומה DCs, תאים B להראות ביטוי מוגבר של MHC ושיתוף גירוי מולקולות (Fig.1b), מפגינים יכולת הנדידה חזק מצגת להציג ביעילות אנטיגן ותאי T, לאחר גירוי עם ליגנד interleukin-4 ו CD40 (CD40L). עם זאת, בניגוד DCs בוגר או בוגרת, CD40 בתאי B-לבטא את לימפה הצומת השלישיה ביות מלא המורכב CD62L, CCR7/CXCR4, ותפקוד ליקוציט אנטיגן-1 (LFA1, CD11a/CD18), הכרחי ביות הלימפה לאיברים משני (Fig.1a) ^3. תאים CD40-B יכול להיווצר ללא קשיים של כמויות קטנות מאוד של דם היקפיים אשר ניתן להרחבה נוספת במבחנה על כמויות גדולות מאוד של הפערים טהור CD40-B תאים סרטניים (> 10 ⁹ תאים לכל מטופל) מתורמים בריאים, כמו גם חולים (Fig.1c, ד) ^1,4.

בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד להשיג מופעל במלואו CD40-B תאים PBMC האדם. מולקולות מרכזיות בתרבות התא CD40 ליגנד, interleukin-4 (IL-4) ציקלוספורין A (CSA), אשר מתחדש בכל יום מחזור 3-4 התרבות. לענין מעבדה CD40 גירוי מסופק על ידי תאים NIH/3T3 להביע רקומביננטי אנושי CD40 ליגנד (tCD40L NIH/3T3) ^5. כדי למנוע זיהום עם הלא transfected תאים, ביטוי של ליגנד CD40 האדם על transfectants יש להיבדק באופן קבוע (Fig.2).

לאחר 14 ימים CD40-B בתרביות תאים מורכבים יותר טהור 95% תאים B ו הרחבה של CD40-B תאים מעל 65 ימים ניתן לעתים קרובות ללא כל אובדן של ^{1 לתפקד, 4.} תאים CD40-B ביעילות לקחת, תהליך להציג אנטיגנים לתאי T ^6. הם לא רק naϊve הממשלה, אלא גם להרחיב את הזיכרון בתאי T ^7,8. CD40 המופעל בתאי B יכול לשמש כדי ללמוד B-cell, הפעלת התמיינות ותפקוד. יתר על כן, הם מייצגים כלי מבטיח עבור חיסון או טיפול מונע נגד גידולים ^9.

Protocol

פרוטוקול עבור הדור של CD40 המופעל בתאים אנושיים B מ PBMC מחולק לשני חלקים: חלק א 'מדגים את הכנת CD40 ליגנד להביע NIH/3T3 תאים, אשר ישמש צלחת הנכנס לתאים מזין. חלק ב 'מתאר את התרבות בפועל CD40-B.

א הכנת תאים מזין (tCD40L NIH/3T3)

NIH/3T3 tCD40L הוא תא חסיד Murine פיברובלסטים קו, שלא צריך להיות ומחוברות לגמרי. התאים splitted ולכן פעמיים בשבוע. Culturing על יותר מ 6 שבועות לא מומלץ.

הסר בינוני הישן מתרבות הראשוני עם פיפטה סטרילית ולשטוף תאים עם 10 מ"ל של 1x PBS. לשאוב PBS לאחר כביסה.
הוסף 4 מ"ל טריפסין / EDTA בתוך בקבוקון 75 ס"מ ² למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. השתמש הקשה עדין לנתק את התאים.
הוסף 10 מ"ל של מדיום סוג בר המסתובב בעדינות.
מעבירים את ההשעיה התא לתוך שפופרת 50 מ"ל עם טפטפת סטרילית ספין התאים לעבר XG 225 דקות 5.
הסר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מ"ל של מדיום סוג בר. ספירת תאים של aliquot ההשעיה התא להכין שלושה צינורות 50 מ"ל עם מספר מתאים של תאים:
1. 1.5 x 10 ⁶ תאים subculturing
2. 0.2 x 10 ⁶ תאים / היטב הקרנה המשמש תרבות CD40-B לתא
3. שאר להקפיא (במידת הצורך).
ספין התאים לעבר XG 225 דקות 5.
הסר את supernatant.
1. עבור subculturing: resuspend 1.5 x 10 ⁶ תאים 10 מ"ל בינוני בר להקליד 75 ס"מ ² בקבוק תא התרבות (צפיפות התאים 1.5 x 10 ⁵ תאים / מ"ל), מוסיפים G-418 [0.7 מ"ג / מ"ל] ו דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO _2. פיצול התאים פעמיים בשבוע.
2. במשך תרבות CD40-B התא: אתה צריך 1.2 x 10 ⁶ תאים צלחת 6-גם אחד. Resuspend התאים בינוני סוג בר בצפיפות של 0.1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל ו - מקרינים אותם 78 Gy. פלייט 2 מ"ל של ההשעיה לתוך כל תא היטב דגירה אותם 37 ° C עם 5% CO _2. השתמש צלחות מוכן גירוי B-cell כאשר tCD40L NIH/3T3 תאים חסיד (לפחות 4 שעות: הדבקות לבדוק עם מיקרוסקופ, לא לחכות יותר מ 24 שעות כדי להתחיל B-cell גירוי). (המשך ב)

ב 40 CD-B תרבית תאים

I. הכנת PBMCs לגירוי-CD40 (יום 0):

שימו לב: לפני שאתה ממשיך לוודא כי הם תאים מזין חסיד. תמיד להוסיף פתרונות טריים של interleukin-4 ו ציקלוספורין למדיום הגידול מיד לפני השימוש.

קח PBMCs, או טרי או מופשר כראוי. Resuspend PBMCs פעמיים 50 מ"ל של 1x PBS לשטוף אותם ספין למטה בפעם הראשונה ב XG 265 דקות 7 ופעם שנייה ב XG 190 דקות 7 להסיר תאים אחרים. בטל supernatant ו resuspend התאים 20 מ"ל של PBS. קבע את מספר תא aliquot ההשעיה התא.
ספין למטה הכמות הנדרשת של תאים ב XG 225 דקות 5. עבור צלחת 6-באר 4 x 10 ⁶ תאים / גם יש צורך, ובכך 24 x 10 ⁶ תאים לכל צלחת.
הסר את supernatant ו resuspend PBMC ב 1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל במדיום CD40 B-תרבות בתוספת טרי עם 50 U / mL של interleukin-4 כגורם צמיחה 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין כדי למנוע תוצאה של T-תאים (ריכוזים בהתחשב מתייחסים בינוני תרבות אחת מ"ל!).
הסר את supernatant מ 6 גם צלחת מראש מודגרות עם NIH/3T3 תאים tCD40L.
שטפו את חסיד tCD40L NIH/3T3 תאים עם 2 מ"ל PBS לכל טוב הראשון בשלב השני עם 2 מ"ל של מדיום CD40 B-הכביסה.
בעדינות להוסיף 4 מ"ל של השעיה PBMC (1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל) היטב בכל צלחת 6-הבאר.
דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO _2.
ביום 7, reculture התאים (המשך 3.2.).

השנייה. Recultivation של CD40-B תאים (יום 7 ואז כל 3-4 ימים):

הבציר אשכולות של CD40 בתאי B-6-מהצלחת היטב על ידי resuspending עם פיפטה 10 מ"ל ובריכת אותם לתוך שפופרת 50 מ"ל.
ספין למטה XG 225 במשך 7 דקות, לגמרי להחליף את supernatant עם המדיום CD40 B-הכביסה. בעוד לספור את כמות התאים של aliquot, לסובב את התאים לעבר XG 225 במשך 5 דקות. Resuspend CD40 בתאי B-בינוני CD40 B-תרבות בריכוז של 1 x 10 ⁶ תאים / מ"ל.
הוספת פתרונות טריים של interleukin-4 בריכוז של 50 U / mL ו - 0.63 מיקרוגרם / מ"ל ציקלוספורין למדיום.
הסר את supernatant מהצלחת 6-היטב מראש מודגרות עם NIH/3T3 תאים tCD40L.
לשטוף את התאים חסיד עם 2 מ"ל PBS לכל טוב הראשון בשלב השני עם 2 מ"ל של מדיום CD40 B-הכביסה.

6 תאים / מ"ל) של השעיה CD40-B היטב בכל צלחת 6-הבאר.

דגירה צלחות ב 37 ° C עם 5% CO ^2.

תאים תת שוב כל 3-4 ימים כדי לגמור עם טהור מאוד CD40 המופעל בתאים אנושיים B לאחר סך של 14 ימים.

ג בעיות הירי - מה אם תאים CD40-B אינם גדלים?

בדקת ביטוי CD40 ליגנד של תאים מזין?
צלחת הנכנס מזין תאים המשמשים גירוי לא צריך להיות מעל גיל 24 שעות?
האם זיהום אפשרי עם mycoplasma?
האם הפתרון interleukin-4 המשמש כתוסף מופשר טרי והיה לו את הפעילות הביולוגית המתאים?
האם ציקלוספורין נוסף בריכוז הנכון?

באיור 1. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של דמות 1.

איור 2. אנא לחץ כאן עבור גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. Preparation of Media:
1. Feeder cell wild type medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
2. Feeder cell selection medium
DMEM-Ham’s / F12
L-Glutamine (365 μg/mL)
FBS (10%)
HEPES (10 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
G-418 (0.7 mg/mL)
3. CD40-B washing medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
4. CD40-B culture medium
IMDM
L-Glutamine (584 μg/mL)
HEPES (25 mM)
Gentamycin (15 μg/mL)
rh Transferrin (50 μg/mL)
rh Insulin (5 μg/mL)
AB-Humanserum (10%)
B. Miscellaneous Reagents:

DMEM / Ham’s F12	PAA Laboratories	Cat No: E15-813
IMDM	Invitrogen	REF 21980-032
Dulbecco’s PBS (10x)	PAA Laboratories	Cat No H15-011
AB-Human Serum	Invitrogen	Cat No 34005100
holo-Transferrin human	Sigma-Aldrich	Cat No T0665
Insulin human	Sigma-Aldrich	Cat No I2643
Gencin®	Delta Select	Art No 7395800
Recombinant Human Interleukin-4	Immunotools	Cat No 11130045
Cyclosporin A	Novartis AG	Cat No NDC 0078-0109-01
FBS	Lonza Inc.	Cat No DE14-802C
HEPES Buffer	PAA Laboratories	Cat No S11-001
G-418 Sulphate	PAA Laboratories	Cat No P02-012
Trypsin/EDTA (10x)	Invitrogen	REF 15400-054
C. Miscellaneous Supplies:

Sterile pipette tips	Sarstedt Ltd
6-well plate	Nalge Nunc international	Cat No 140675
50mL conical tube	BD Biosciences	Cat No 352070
Tissue culture flask	Sarstedt Ltd	Cat No 83.1813.002