Summary
Bu video mevcut
Abstract
CD40-aktive B hücreleri (CD40-B hücreleri) immüno-uyarıcı antijen sunan hücreler (APC), kanser immünoterapi için 1-3 alternatif bir kaynak olarak tespit edilmiştir . CD40-B hücreleri birkaç farklı biyolojik ve teknik özellikleri Dendritik hücreler (DH), en iyi karakterize APC ile karşılaştırıldığında. DC'ler benzer şekilde, B hücreleri MHC ve co-uyarıcı moleküller (Fig.1b) artmış ekspresyonu, interlökin-4 ve CD40 ligand (CD40L) ile stimülasyon sonra, güçlü bir göçmen kapasite ve mevcut antijen sunumu T hücrelerinin verimli sergilerler. Ancak, olgunlaşmamış ya da olgun DC'ler aksine, CD40-B hücreleri CD62L, CCR7/CXCR4 oluşan tam bir lenf nodu homing üçlüsü ifade ve ikincil lenfoid organlara homing gerekli lökosit fonksiyon antijen-1 (LFA1, CD11a/CD18) (Fig.1a) 3 CD40-B hücreleri, periferik kanda çok az miktarda daha yüksek saf CD40 B hücreleri sağlıklı donörlerden (> 10 9 hasta başına hücreleri) yanı sıra kanser çok büyük miktarda in vitro açılabilir zorluklar olmadan oluşturulabilir hasta (Fig.1c d) 1,4.
Bu protokol, insan hücre tamamen aktif CD40-B hücreleri nasıl elde göstermektedir. Hücre kültürü için anahtar moleküller CD40 ligand, interlökin-4 (IL-4) ve siklosporin A (CsA), 3-4 günde bir kültür döngüsü yenileniyor. Laboratuvar amaçları için CD40 stimülasyon, rekombinant insan CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5 ifade NIH/3T3 hücreleri tarafından sağlanmaktadır . -Transfekte olmayan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için, transfektanları insan CD40 ligand ekspresyonu (Şekil 2) düzenli olarak kontrol edilmelidir.
14 gün sonra CD40 B hücre kültürleri fazla% 95 saf B hücreleri CD40-B hücreleri ve 65 gün içinde bir genişleme sık fonksiyonu 1, 4 herhangi bir kayıp olmaksızın mümkün oluşur. CD40-B hücreleri verimli, süreç kadar sürebilir ve T hücrelerinin mevcut antijenler 6. Sadece başbakan naϊve değil, aynı zamanda bellek T hücreleri 7,8 genişletmek. CD40 ile aktive olan B hücreleri, B-hücre aktivasyonu, farklılaşma ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir. Ayrıca, tümörler 9 karşı tedavi veya önleyici aşı için umut verici bir aracı temsil eder.
Protocol
PBMC insan CD40 aktive B hücreleri üretimi için protokol iki bölüme ayrılmıştır: Kısım A plaka bağlı besleyici hücreler olarak kullanılacaktır NIH/3T3 hücreleri, CD40 ligand ifade hazırlanmasında gösteriyor. Bölüm B, gerçek CD40-B kültür açıklar.
A. besleyici hücreler Hazırlama (tCD40L NIH/3T3)
TCD40L NIH/3T3 tamamen konfluent haline asla yapışkan bir fare fibroblast hücre hattı,. Hücreler bu nedenle haftada iki kez parçalı. Daha fazla 6 hafta içinde Kültürleme tavsiye edilmez.
- Steril bir pipet ile primer kültür eski orta çıkarın ve 10 ml 1x PBS ile yıkayın hücreleri. PBS ile yıkandıktan sonra aspire.
- 37 °, 5-10 dakika için 75 cm 2 balon 4 ml tripsin / EDTA ° C Hücreleri ayırmak için hafif dokunarak kullanın.
- Vahşi tip orta 10 ml ekleyin ve hafifçe dönebilen.
- Hücre süspansiyonu steril bir pipet yardımıyla 50 ml tüp içine aktarın ve 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı döndürün.
- Süpernatantı ve vahşi tip orta 10 ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısı sayın ve uygun sayıda hücre ile üç 50 ml tüpler hazırlamak:
- Alt kültüre için 1.5 x 10 6 hücre
- 0.2 x 10 6 hücre / CD40 B hücre kültürü için kullanılan ışınlama
- dondurmak için geri kalan (gerekirse).
- 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı spin.
- Süpernatantı.
- Alt kültüre için tekrar süspansiyon 75 cm 2 hücre kültürü şişesi 10 ml vahşi tip orta (hücre yoğunluğu 1.5 x 10 5 hücre / ml) 1.5 x 10 6 hücre, G-418 [0.7 mg / ml] ve hücrelerin inkübe % 5 CO 2 ile 37 ° C. Haftada iki kez hücreleri bölün.
- CD40 B hücre kültürü için bir adet 6-plaka için 1.2 x 10 6 hücre gerekir. 0.1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu vahşi tip orta hücrelerin yeniden süspanse edin ve 78 Gy ışın tedavisi. Yanı sıra, her 37 ° inkübe ° C ile% 5 CO 2 hücre süspansiyonu Plaka 2 mL. TCD40L NIH/3T3 hücreleri yapışık B-hücre uyarılması için hazırlanmış tabak kullanın (en az 4 saat: mikroskop ile bağlılık kontrol edin; B-hücre stimülasyon başlatmak için 24 saat daha beklemek gerekmez). (B. devam)
B. CD 40-B hücre kültürü
CD40 stimülasyon (gün 0) PBMC'ler I. Hazırlık:
Lütfen dikkat: besleyici hücreler yapışık olduğu tespit devam etmeden önce. Interlökin-4 ve siklosporin besi kullanımdan hemen önce taze çözümler her zaman ekleyin.
- , Taze veya uygun bir şekilde çözülmüş ya PBMC'ler alın. Süspanse edin, iki kez yıkayın ve ilk kez 7 dakika ve diğer hücreleri çıkarmak için ikinci kez 7 dakika süreyle 190 xg'de 265 xg'de aşağı spin 50ml 1x PBS PBMC'ler. Süpernatant atın ve 20 ml PBS hücrelerin tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısını belirler.
- 5 dakika boyunca 225 xg'de hücrelerin gerekli miktarda aşağı spin. 6 plaka 4 x 10 6 hücre / kuyu, böylece plaka başına 24 x 10 6 hücre ihtiyaç vardır.
- T-hücrelerinin büyüme faktörü ve 0,63 mg / ml siklosporin gibi bir akıbet önlemek için 1 x 10 6 hücre / ml taze interlökin-4 50 U / ml ile desteklenmiş CD40-B kültür ortamı PBMC tekrar süspansiyon süpernatantı (Verilen konsantrasyonları bir ml kültür ortamı bakın!).
- Süpernatantı 6-plaka ön tCD40L NIH/3T3 hücreleri ile inkübe.
- 2 ml PBS başına ilk ve CD40-B yıkama orta 2 mL ikinci bir adımda yapışık tCD40L NIH/3T3 hücreleri yıkayın.
- 6-plaka Her iyi yavaşça PBMC süspansiyon 4 ml (1 x 10 6 hücre / ml) ekleyin.
- 37 hücreleri inkübe ° C ile% 5 CO 2.
- 7 gün, hücreleri (3.2 ile devam edin.) Reculture.
II. CD40-B hücreleri (7 gün ve daha sonra her 3-4 gün) Recultivation:
- 50 ml tüp içine 10 ml pipet ve havuz onları resuspending 6-plaka CD40-B hücreleri Harvest kümeleri.
- 7 dakika boyunca 225 xg'de Spin ve süpernatant tamamen CD40-B yıkama orta yerine. Bir kısım hücre miktarını sayma, 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon CD40-B kültür ortamında süspanse edin CD40-B hücreleri.
- 50 U / ml konsantrasyonu ve 0.63 mg / ml orta siklosporin A interlökin-4 taze çözümler ekleyin.
- 6 plaka tCD40L NIH/3T3 hücreleri önceden inkübe süpernatantı.
- 2 ml PBS başına ilk ve CD40-B yıkama orta 2 mL ikinci bir adımda yapışık hücrelere yıkayın.
- 37 ° plakaları inkübe ° C,% 5 CO 2 .
- Altkültür hücreleri yeniden her 3-4 günde bir toplam 14 gün sonra son derece saf bir insan CD40 aktive B hücreleri ile sonuna kadar.
C. Sorun Giderme - CD40-B hücreleri büyümek yoksa?
- Besleyici hücreler CD40 ligand ifade için kontrol ettiniz?
- Plaka bağlı uyarılması için kullanılan besleyici hücreler 24 saat daha büyük olması gerekmez mi?
- Mycoplasma mümkün olan bir kirlenme mi?
- Interlökin-4 çözüm takviyesi için kullanılan, taze çözülmüş ve uygun biyolojik aktivite vardı?
- Siklosporin A doğru konsantrasyon eklendi?
Şekil 1: Lütfen burada Şekil 1'de bir büyük versiyonu için tıklayın .
Şekil 2 Lütfen buraya tıklayın Şekil 2 daha büyük bir versiyonu için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. Preparation of Media: | |||
| 1. Feeder cell wild type medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 2. Feeder cell selection medium | |||
| DMEM-Ham’s / F12 | |||
| L-Glutamine (365 μg/mL) | |||
| FBS (10%) | |||
| HEPES (10 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| G-418 (0.7 mg/mL) | |||
| 3. CD40-B washing medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| 4. CD40-B culture medium | |||
| IMDM | |||
| L-Glutamine (584 μg/mL) | |||
| HEPES (25 mM) | |||
| Gentamycin (15 μg/mL) | |||
| rh Transferrin (50 μg/mL) | |||
| rh Insulin (5 μg/mL) | |||
| AB-Humanserum (10%) | |||
| B. Miscellaneous Reagents: | |||
| DMEM / Ham’s F12 | PAA Laboratories | Cat No: E15-813 | |
| IMDM | Invitrogen | REF 21980-032 | |
| Dulbecco’s PBS (10x) | PAA Laboratories | Cat No H15-011 | |
| AB-Human Serum | Invitrogen | Cat No 34005100 | |
| holo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | Cat No T0665 | |
| Insulin human | Sigma-Aldrich | Cat No I2643 | |
| Gencin® | Delta Select | Art No 7395800 | |
| Recombinant Human Interleukin-4 | Immunotools | Cat No 11130045 | |
| Cyclosporin A | Novartis AG | Cat No NDC 0078-0109-01 | |
| FBS | Lonza Inc. | Cat No DE14-802C | |
| HEPES Buffer | PAA Laboratories | Cat No S11-001 | |
| G-418 Sulphate | PAA Laboratories | Cat No P02-012 | |
| Trypsin/EDTA (10x) | Invitrogen | REF 15400-054 | |
| C. Miscellaneous Supplies: | |||
| Sterile pipette tips | Sarstedt Ltd | ||
| 6-well plate | Nalge Nunc international | Cat No 140675 | |
| 50mL conical tube | BD Biosciences | Cat No 352070 | |
| Tissue culture flask | Sarstedt Ltd | Cat No 83.1813.002 | |
References
- Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
- Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
- Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
- Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
- Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
- Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
- von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
- Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
- Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).
