تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام microinjection وعالية الدقة في التصوير

Abstract

يصف هذا البروتوكول استخدام الأجنة melanogaster ذبابة الفاكهة لدراسة الانقسام المخلوي ^1. ذبابة الفاكهة والوراثة مفيدة مع تسلسل الجينوم ، ويمكن بسهولة أنها حافظت والتلاعب بها. وجود العديد من المسوخ الإنقسامية ، ومعربا عن الذباب المعدلة وراثيا وظيفية fluorescently (GFP مثلا) -- البروتينات الإنقسامية الموسومة تم ويتم إنشاؤها حاليا. استهدفت التعبير الجيني هو ممكن باستخدام نظام GAL4/UAS ^2.

الجنين في وقت مبكر ذبابة الفاكهة ينفذ mitoses متعددة بسرعة كبيرة (خلية مدة الدورة ، ≈ 10 دقيقة). وهو مناسب تماما عن الانقسام والتصوير ، لأنه خلال دورات 10-13 ، نواة الانقسام بسرعة وبشكل متزامن دون التدخل الحرائك الخلوية على سطح الجنين في أحادي الطبقة واحدة فقط تحت القشرة. هذه النوى تقسيم بسرعة على الأرجح استخدام الآلية الإنقسامية نفس الخلايا الأخرى ، ولكن ما هي الأمثل للسرعة ، ويعتقد عموما أن لا يكون نقطة تفتيش صارمة ، والسماح للدراسة البروتينات الإنقسامية الذي سيسبب عدم اعتقال خلية دورة في زنزانات مع نقطة تفتيش قوية . ويمكن التعبير عن البروتينات الأجنة GFP المسمى أو microinjected مع بروتينات fluorescently المسمى التقط بسهولة لمتابعة ديناميكية حية (الشكل 1). بالإضافة ، يمكن microinjected الأجنة مع وظيفة حجب الأضداد أو مثبطات لبروتينات محددة لدراسة تأثير فقدان أو اضطراب وظيفتها ^3. يمكن لهذه الكواشف منتشر في جميع أنحاء جنين ، حيث بلغت مغزل لانتاج العديد من الانحدار تركيز مثبط ، والتي تؤدي بدورها في الانحدار من عيوب مماثلة لسلسلة أليلية من المسوخ. من الناحية المثالية ، إذا fluorescently المسمى البروتين المستهدفة ، ويمكن التدرج من تثبيط يمكن تصور مباشرة ^4. فمن المفترض أن أقوى النمط الظاهري هو مشابه إلى النمط الظاهري فارغة ، على الرغم من أنه من الصعب استبعاد احتمال رسميا أن الأجسام المضادة قد تكون لها آثار المهيمنة في حالات نادرة ، والضوابط الصارمة وتفسير ذلك الحذر يجب أن يطبق. بعيدا عن موقع الحقن ، وظيفة البروتين هو فقط السماح فقدت جزئيا وظائف أخرى من البروتين المستهدف لتصبح واضحة.

Protocol

وصفات :

لوحات عصير العنب :

• 5.5g bacto آغار
• 14.5 غرام سكر العنب او الجلوكوز
• 7.15 ز سكروز
• 45 مل من عصير العنب التركيز (100 ٪ عصير).
• 204.5 مل من H ₂ 0
• 625 ميكرولتر 10N هيدروكسيد الصوديوم

مزيج جميع المكونات والميكروويف حتى الغليان.
إضافة 2.8 مل من مزيج حمض (حمض مزيج : 20.9 مل حمض البروبيونيك ، 2.1 مل حمض الفوسفوريك ، و 27 مل من H ₂ 0)

ويسكب المزيج على أطباق بتري 35 ملم. اسمحوا يصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم أو يومين. إذا لوحات ليست على وشك أن يستخدم في وقت قريب ، مع ختم parafilm والحفاظ على 4 درجات مئوية (السماح للتوازن لRT قبل استخدام).

لصق الخميرة :

إذابة حوالى ملعقة صغيرة من الخميرة (سيغما YSC2 ، خميرة البيرة السكيراء من النوع الثاني) في الماء لتكوين عجينة سميكة. ضع كمية صغيرة من هذا على كل لوحة عصير العنب فقط قبل استخدامه.

G - PEM العازلة :

• 80 ملم نا أنابيب ، ودرجة الحموضة 6.9
• 1 ملم MgCl ₂
• 1 ملم EGTA
• 1 ملم GTP

حقن العازلة :

• K - 150 مم الأسبارتات
• 10 ملي K - الفوسفات
• 20 ملي إيميدازول ، ودرجة الحموضة 7.2

هيبتان الغراء :

انبسط شريط لاصق مزدوج ووضعه في زجاجة 100ML ، إضافة حوالي 50ml هيبتان ، ختم زجاجة ، والصخور لعدة أيام. عند استخدام ، إضافة هيبتان إذا الغراء سميكا جدا.

الجفاف الغرفة :

تأخذ طبق بيتري 100 ملم ، وطرح جزء واحد من 35 مم داخل صحن لتقديم "جدول" وإضافة Drierite (كبريتات الكالسيوم اللامائية) حول هذا الأمر بحيث ارتفاع Drierite ليست أعلى من "الجدول" و الغطاء. سيتم وضع ساترة مع الأجنة على هذا "الجدول" لجفاف قبل الحقن. انها فكرة جيدة لاستخدام ما لا يقل عن بعض تشير Drierite وتغييره اذا كان قد تغير اللون.

البروتوكول :

ويمكن استخدام هذا البروتوكول لحقن أي كاشف للذوبان تقريبا في جنين ذبابة الفاكهة المخلوي : على سبيل المثال ، إما بروتين فلوري للمراقبة أو مثبط البروتين المستهدف أو كليهما.

الحصول على كل شيء جاهزا :

1.- 2 إلى 3 أيام قبل التجربة ، وجعل لوحات عصير العنب واقامة وضع القفص : خذ زجاجة من البلاستيك (6 أوقية ، ذهابا وإيابا من أسفل التطبيقية العلمية ذبابة الفاكهة) ، وقطع اثنين من الثقوب الصغيرة (حوالي 1cm ²⁾ على طرفي نقيض من وملء الزجاجة بقطعة قطن (وهذا سوف يسمح لتدفق الهواء) ، اضغط على الذباب في زجاجة ، وتغطي مع لوحة عصير العنب. إبقاء على درجة حرارة 25 درجة مئوية (أو درجة حرارة الغرفة) ، وينبغي وضع الذباب الأجنة لنحو 10 يوما.

2.- ما لا يقل عن يوم واحد قبل التجربة سحب الإبر للحقن ، ونحن نستخدم إبرة Kopf / الماصة مجتذب طراز 720 و شعيرات رقيقة الجدران الزجاجية (البنك الآلات الدقيقة tw100f). لحقن تويولين الفلورسنت ، والحفاظ على الإبر في 4 درجات مئوية لمنع درجة الحرارة التي يسببها البلمرة في الإبرة.

تويولين التحضير :

ملاحظة : يجب أن يتم العمل مع جميع تويولين في 4 درجات مئوية لمنع البلمرة.

1. تأخذ تويولين المسمى من الثلاجة ووضعها على الجليد لمدة 5 إلى 15 دقيقة.
2. تمييع مع G - PEM العازلة (من 4 إلى 10 أضعاف تبعا للكثافة المطلوبة).
3. الطرد المركزي في دورة في الدقيقة 13K عند 4 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
4. تحميل 1-2 ميكرولتر في الإبرة.

الضد أو مثبط الكيميائية :

تعد الإبر بالنسبة تويولين ، وذلك باستخدام التركيز المناسب (وهذا قد تحتاج إلى اختبار). يمكن أن يكون في الضد العازلة الحقن ، G - PEM العازلة أو برنامج تلفزيوني. إذا كان هناك حاجة لالعازلة ، وسوف تحتاج إلى هذا المخزن المؤقت يتم حقنه كعنصر تحكم للتأكد من هذا المخزن المؤقت يسبب أي ضرر من تلقاء نفسها.

ملاحظة : يمكن أن تكون مختلطة والمانع الفلورسنت تويولين وحقن معا إذا كانت تركيزات تسمح بذلك. خلاف ذلك ، حقن تويولين الفلورسنت وانتظر 5 إلى 10 دقائق قبل حقن المانع. عند إجراء الحقن المزدوج ، وتبدأ مع مزيد من الأجنة ، منذ أقل من الأجنة سوف يتعافى بشكل طبيعي.

جمع الأجنة :

1. وضع عصير العنب لوحة جديدة على وضع قفص.
2. إزالة هذا الطبق بعد ساعة واحدة ، وهذه هي المجموعة الأولى من النهار ، وغالبا ما تكون ليست جيدة جدا. ويمكن تجاهل ذلك.
3. تغيير لوحة في كل ساعة للحفاظ على جمع الأجنة لمدة ساعة واحدة لكل منهما.

ساترة التحضير :

1. وضع ساترة × 50 22mm و على جانب واحد من شريحة المجهر. الشريط الزوايا الأربع إلى الشريحة بحيث لا تتحرك.
2. باستخدام قطعة من القطن يميل التطبيقية ، وضعت طبقة واحدة من الغراء هيبتان في سطر واحد على ساترة (الغراء لا ينبغي أن تكون لزجة ، وينبغي أن تجف في بضع ثوان ، إضافة خلاف أكثر هيبتان).
3. وضع قطعة منالمزدوج شريط لاصق على الانزلاق نحو جانب ساترة.

جنين التحضير :

ملاحظة : يجب أن يكون تصوير الجنين حوالي 2 بعد ساعات من بدء المجموعة ، بحيث تبدأ الخطوات التالية يتيح وقتا كافيا للانتهاء منها في هذا الإطار الزمني.

1. بفرشاة مبللة اختيار بعناية حتى الأجنة من عصير العنب لوحة ومكان على الشريط اللاصق المزدوج على الشريحة.
2. باستخدام الجزء الخارجي من ملاقط ، ولفة الأجنة أكثر من الشريط المزدوج لزجة حتى المشيماء (الغشاء الخارجي) فواصل مفتوحة.
3. التقاط الجنين قبل المتداول برفق على المشيماء ذلك تتمسك منتاش ووضعه على الغراء هيبتان على ساترة مع الجانب طويلة من خط الجنين الى جانب طويلة من ساترة. إعداد 10-20 الأجنة في صف واحد.
4. إزالة ساترة ووضعه في غرفة الجفاف لمدة 3 إلى 8 دقائق (وهذا يعتمد على نسبة الرطوبة في الغرفة ، والمبلغ الذي يتم حقنه).
5. مكان في غرفة مع الشحوم المعدنية فراغ.
6. تغطية الأجنة مع 700 الهالوكربون النفط لتجنب المزيد من الجفاف. الأجنة هي الآن جاهزة للحقن.

حقن الجنين :

1. العثور على الأجنة في إطار الهدف 16X.
2. نقل الأجنة بعيدا ، والعثور على ابرة دون تحريك الطائرة التنسيق.
3. مركز الإبرة ونقلها من دون تحريكه في اتجاه x أو ذ.
4. إذا كانت الإبرة غير مفتوح ، وضعت على حافة ساترة في مجال الرؤية ، ولكن ليس فيها الإبرة ستكون ، وخفض الإبرة إلى الطائرة الاتصال نفسه. نقل جدا بعناية ساترة حتى يضرب الإبرة بلطف وفواصل مفتوحا. إذا كانت إبرة فتح ، انتقل إلى الخطوة 5. (يمكن فتح إبر مع حامض الهيدروفلوريك قبل ملء).
5. وضع الأجنة في عرض (ولكن ليس فيها الإبرة وسوف) ، وانخفاض الإبرة في النفط وتأكد من الحصول على قطرات السائل لطيفة من الإبرة.
6. نقل بعناية ولكن بثبات الجنين في إبر وحقن تسقط في جنين ونقل الجنين بعيدا. (أو اتباع تعليمات جهاز الحقن الخاص بك).
7. بعد أن تم حقن جميع الأجنة ، وهم مستعدون للمراقبة على مبائر المجهر.

التصوير :

صورة الأجنة على المجهر مبائر مع الهدف 60 أو 100X :
ملاحظات :

1. وينبغي أن الفاصل الزمني على سلسلة الوقت الفاصل تكون في معظم ثوان قليلة ، ومنذ الانقسام في الجنين سريع جدا ، اعتمادا على العملية الدقيقة التي يتعين دراستها.
2. يمكن الحصول على سلسلة 3D أو طائرة واحدة اعتمادا على عملية الفائدة.
3. لمثبطات سريع المفعول ، ونقل من الحقن لمجهر مجهر التصوير يجب أن يكون سريعا.

الشكل 1 : دراسة الانقسام في جنين ذبابة الفاكهة المخلوي. النوى في الجنين في وقت مبكر من دون الخضوع لانقسامات سريعة الحرائك الخلوية ، خلال دورات من 10 إلى 13 (أ) شكل نواة المونولاير في القشرة. A. التخطيطي الجنين في وقت مبكر مع النوى في القشرة. ويمكن التعبير عن GFP الجنين و / أو البروتينات المسماة RFP ويمكن microinjected مع غيرها من البروتينات المسماة و / أو مثبطات. باء التصوير مرور الزمن من جنين ، معربا عن GFP تويولين وRFP - هيستون. جيم قطعة من قطب قطب لدورات الفصل 11 و 12 و 13 في جنين نوع البرية. المعارض طول فترات المغزل طول متساوي القياس وفترات الاستطالة ، والتي هي متسقة للغاية وقابلة للتكرار. حيوية دال ميكروتثبول المغزل. حقن تركيز منخفض من تويولين رودامين يؤدي إلى تشكل بقع من مفارز تويولين قليلة ، والتي يمكن استخدامها لدراسة ديناميات أنيبيب.

Discussion

هذا البروتوكول هو بسيط نسبيا ، ومع ذلك ، يتطلب ممارسة كل خطوة للتأكد من عدم تلف الأجنة. تجارب التحكم الدقيق دائما بحاجة إلى القيام به لضمان أن يتم الحصول على نتائج موثوقة. واحد وسيلة جيدة لبدء هذه هي microinjecting العازلة أو رودامين تويولين في التعبير عن السيطرة الأجنة GFP - تويولين للتأكد من أن الانقسام العائدات عادة من خلال جميع الدورات على سطح الجنين (دورات من 10 إلى 13). التحكم في الأجنة يجب أن لا نلاحظ أي اتصالات فعلية بين مغزل التي غالبا ما تكون نتيجة للجفاف كثيرا ، وأقل ذلك الوقت الجفاف. عندما معطوبة الأجنة والغبار النووي لوحظ في كثير من الأحيان ، أو تباعد الخطوط centrosomes متفاوتة من نوى أو مغزل تدل على الضرر. قطع مسافة قطب قطب واستنساخه جدا وهي مقياس موثوق جدا من "النجاح" ، في مراقبة الأجنة ينبغي أن تبدو مثل تلك التي تظهر في الشكل 1.

وقد استخدمنا هذا البروتوكول لدراسة العديد من جوانب الصيانة المغزل ، والتجمع ، واستطالة به وحيدة النسيلة ، والأجسام المضادة أو ببتيد النسائل المتعددة التي أثيرت ضد هذا البروتين من الفائدة ^{1،5،6،7،8،9،10،11،12،13.} يمكن مثبطات البروتين محددة أو غيرها من المواد الكيميائية التي تؤثر على البروتين تهم أيضا أن microinjected ولاحظ آثارها وتقاس كميا. لتقييم تأثير مثبط خاص لنا أن نقارن طول المغزل بعد إعاقة لتلك التي لوحظت في مراقبة الأجنة. يمكننا أن ننظر أيضا في ديناميات تويولين باستخدام الميكروسكوب نيون الرقطة ¹⁴ بعد microinjection لتركيز منخفض من تويولين فلوري (شكل 1D).

نجمعها عموما لساعة واحدة وترك أجنة ناضجة لمدة ساعة قبل أكثر المراقبة ، وهذا يعني أن الأجنة ما بين 1 و 2 ساعات من العمر عندما لاحظ. إذا كان الذباب وضع جيد ويتم جمع العديد من الأجنة في ساعة واحدة ، ويجوز عندئذ يمكن اختصار الوقت بحيث يتم جمع الحصول على مزيد من أجنة بشكل متزامن الفاصل. إذا كان توقيت تثبيط أمر بالغ الأهمية أو ذات أهمية بالنسبة للدراسة ، ويمكن حقن تحت الملاحظة مبائر المانع. هذا هو أصعب ، ولكن من الممكن مع ذلك.