Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van micro-injectie en een hoge resolutie beeldvorming in de

Abstract

Dit protocol beschrijft het gebruik van de Drosophila melanogaster syncytieel embryo's voor het bestuderen van mitose ^1. Drosophila is nuttig genetica met een gesequenced genoom, en kan eenvoudig worden onderhouden en gemanipuleerd. Veel mitotische mutanten bestaan, en transgene vliegen uiten van functionele fluorescent (bijv. GFP) - tagged mitotische eiwitten zijn en worden gegenereerd. Gerichte genexpressie is mogelijk met de GAL4/UAS systeem ^2.

De Drosophila vroege embryo voert meerdere mitoses zeer snel (celcyclus duur, ≈ 10 min). Het is zeer geschikt voor de beeldvorming mitose, want tijdens de cycli 10-13, kernen verdelen snel en synchroon zonder in te grijpen cytokinese op het oppervlak van het embryo in een monolaag net onder de cortex. Deze snel delende kernen waarschijnlijk gebruik maken van dezelfde machines als mitotische andere cellen, maar ze zijn geoptimaliseerd voor snelheid, het ijkpunt wordt algemeen aangenomen dat niet te streng, waardoor de studie van de mitotische eiwitten wier afwezigheid zou de celcyclus veroorzaken in cellen met een sterke checkpoint . Embryo's uitdrukken GFP gelabelde eiwitten of gemicroinjecteerd met fluorescent gelabelde eiwitten kunnen eenvoudig worden gescand om te leven dynamiek (fig. 1) te volgen. Daarnaast kunnen embryo's worden gemicroinjecteerd met functie-blokkerende antilichamen of remmers van specifieke eiwitten om het effect van het verlies of verstoring van hun functie ³ studie. Deze reagentia kan diffunderen door het embryo, het bereiken van een groot aantal spindels met een helling van de concentratie van de remmer, die op zijn beurt resulteert in een gradiënt van gebreken die vergelijkbaar zijn met een allelische reeks van mutanten. Productie In het ideale geval als het doel eiwit fluorescent gelabeld is, kan de gradiënt van remming direct gevisualiseerd ^4. Aangenomen wordt dat de sterkste fenotype is vergelijkbaar met de nul-fenotype, ook al is het moeilijk om formeel uitgesloten dat de antilichamen kunnen dominante effecten in zeldzame gevallen, zo strenge controle en voorzichtige interpretatie hebben moeten worden toegepast. Verder weg van de plaats van injectie, eiwit-functie is slechts gedeeltelijk verloren gaat waardoor andere functies van het doelwit eiwit aan zichtbaar worden.

Protocol

Recepten:

Grape Juice platen:

• 5.5g Bacto agar
• 14,5 g dextrose of glucose
• 7,15 g sucrose
• 45 ml druivensap concentraat (100% sap).
• 204,5 ml H ₂ 0
• 625 ul 10N NaOH

Meng alle ingrediënten en een magnetron aan de kook.
Voeg 2,8 ml zure mix (acid mix: 20,9 ml propionzuur, 2,1 ml fosforzuur, 27 ml H ₂ 0)

Mix en giet op 35 mm petrischalen. Laat stollen op kamertemperatuur voor een of twee dagen. Als platen zijn niet van plan om binnenkort worden gebruikt, afdichting met parafilm en blijf bij 4 ° C (laat het aan RT evenwicht voor gebruik).

Gist plakken:

Los ongeveer een theelepel gist (Sigma YSC2, gist Saccharomyces cerevisiae van type II) in water tot een dikke pasta te vormen. Plaats een kleine hoeveelheid van deze op ieder druivensap bord vlak voor gebruik.

G-PEM buffer:

• 80 mM Na-buizen, pH 6,9
• 1 mM MgCl ₂
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

Injectie buffer:

• 150 mM K-Aspartaat
• 10 mM K-fosfaat
• 20 mM imidazool, pH 7,2

Heptaan lijm:

Rol dubbele plakband en plaats in een 100 ml fles, voeg ongeveer 50 ml heptaan, sluit de fles, en rock voor meerdere dagen. Bij het gebruik van, voeg heptaan als de lijm te dik is.

Uitdroging kamer:

Neem een ​​100 mm petrischaal, zet een deel van een 35 mm schotel naar binnen om een ​​"tafel" te maken en toe te voegen Drierite (watervrij calciumsulfaat) rond het zo dat de hoogte van Drierite is niet hoger dan de "tafel" en te dekken. Het dekglaasje met embryo's zullen worden geplaatst op deze "tafel" voor uitdroging vóór de injectie. Het is een goed idee om ten minste een aantal aangeeft Drierite te gebruiken en te wijzigen wanneer het is veranderd kleur.

Protocol:

Dit protocol kan gebruikt worden voor injectie van vrijwel elke oplosbaar reagens in het Drosophila embryo syncytieel: bijvoorbeeld, of een fluorescerend eiwit ter observatie of een doelwit eiwit-remmer of beide.

Aan alles klaar:

1 .- 2 tot 3 dagen voor experiment, maken druivensap borden en het opzetten van lay kooi: Neem een plastic fles (6 oz, ronde bodem van Toegepast Natuurwetenschappelijk Drosophila), twee kleine gaten (ongeveer 1 cm ²⁾ snijden aan weerszijden van de fles en vul deze met een katoenen stuk (dit zal de lucht te laten stromen), tikt u op de vliegen in de fles en bedek het met een druivensap plaat. Bewaren bij 25 ° C (of op kamertemperatuur), moet vliegt leggen embryo's voor ongeveer 10 dagen.

2 .- Ten minste een dag voor het experiment naalden voor injectie trekken, gebruiken we een Kopf Naald / Pipetteer puller model 720 en dunwandige glas filamenten (World precisie-instrumenten tw100f). Voor de injectie van TL-tubuline, houden naalden bij 4 ° C om de temperatuur-geïnduceerde polymerisatie in de naald te voorkomen.

Tubuline voorbereiding:

Opmerking: Alle werken met tubuline moet worden gedaan bij 4 ° C om polymerisatie te voorkomen.

1. Neem het label tubuline uit de vriezer en zet het op ijs gedurende 5 tot 15 minuten.
2. Verdunnen met G-PEM buffer (4 tot 10 maal, afhankelijk van de gewenste intensiteit).
3. Centrifugeer bij 13k rpm bij 4 ° C gedurende 10-15 minuten.
4. Belasting 1-2 ui in de naald.

Antilichaam of chemische inhibitor:

Bereid naalden als voor tubuline, met behulp van een juiste concentratie (dit kan getest moeten worden). Het antilichaam kan worden in injectie buffer, G-PEM buffer of PBS. Als een andere buffer nodig is, zal deze buffer moeten worden geïnjecteerd als een controle om ervoor te zorgen dat deze buffer veroorzaakt geen schade aan zijn eigen.

Let op: Inhibitor en tl-tubuline kunnen worden gemengd en samen geïnjecteerd als de concentraties toestaan. Anders, injecteer de tl-tubuline en wacht 5 tot 10 minuten voor het inspuiten van de remmer. Bij het uitvoeren van een dubbele injectie, te beginnen met meer embryo's, omdat er minder embryo's zal normaal herstellen.

Embryoteams:

1. Plaats een nieuw druivensap plaat op de lay kooi.
2. Verwijder deze plaat na een uur, dit is de eerste collectie van de dag en vaak is niet erg goed. Het kan worden weggegooid.
3. Wijzig de plaat elk uur aan het verzamelen van embryo's te houden gedurende een uur elk.

Dekglaasje voorbereiding:

1. Zet een 50 x 22mm dekglaasje aan een kant van een microscoop dia. Tape de vier hoeken aan de dia zodat het niet bewegen.
2. Met behulp van een katoenen tip applicator, leg een laag van heptaan lijm in een lijn op de dekglaasje (de lijm mag niet viskeus zijn en moet droog in een paar seconden, anders voegt meer heptaan).
3. Leg een stukdubbele kleefband op de dia naar de zijkant van het dekglaasje.

Embryo voorbereiding:

Let op: embryo's worden afgebeeld ongeveer 2 uur na het begin van inzameling, dus begin van de volgende stappen, die voldoende tijd om ze te voltooien binnen dit tijdsbestek.

1. Met een vochtige borstel zorgvuldig pick-up van de embryo's uit het druivensap bord en leg ze op dubbele kleefband op de dia.
2. Met behulp van het buitenste deel van het pincet, rol de embryo's over de dubbele kleefband tot het chorion (het buitenste membraan) breekt open.
3. Pak de embryo door zacht glooiende het over het chorion zo vastzit aan de pincet en plaats deze op de heptaan lijm op de dekglaasje met de lange zijde van het embryo parallel aan de lange kant van het dekglaasje. Opgezet 10 tot 20 embryo's in een rij.
4. Verwijder de dekglaasje en plaats deze in de uitdroging kamer voor 3 tot 8 minuten (dit is afhankelijk van de vochtigheid van de ruimte en de hoeveelheid te injecteren).
5. Leg ze op een metalen kamer met een vacuüm vet.
6. Bedek de embryo's met halogene olie 700 om te voorkomen dat verdere uitdroging. Embryo's zijn nu klaar voor injectie.

Embryo injectie:

1. Vind de embryo's onder een 16x doelstelling.
2. Af te stappen van de embryo's, en vind de naald, zonder het verplaatsen van de focal plane.
3. Het centrum van de naald en beweeg deze omhoog, zonder te bewegen in x-of y-richting.
4. Als de naald niet is geopend, zet de rand van het dekglaasje op het gebied van uitzicht, maar niet waar de naald zal zijn, en laat de naald naar dezelfde focal plane. Heel voorzichtig gaan de dekglaasje totdat hij raakt de naald en voorzichtig breekt open het. Als de naald is geopend, ga dan naar stap 5. (Naalden kan worden geopend met fluorwaterstofzuur voor het vullen).
5. Zet de embryo's met het oog op (maar niet waar de naald zal zijn), hoe lager de naald in de olie en zorg ervoor dat je leuke vloeibare druppels te verkrijgen van de naald.
6. Voorzichtig maar gestaag beweegt het embryo in de naald en injecteer een daling in het embryo en de buurt van de embryo. (Of volg de instructies van uw injectie apparaat).
7. Nadat alle embryo's zijn geïnjecteerd, zijn ze klaar voor waarnemingen aan een confocale microscoop.

Beeldvorming:

Het imago van de embryo's op een confocale microscoop met een 60 of 100x objectief:
Opmerkingen:

1. Het tijdsinterval op een time lapse serie dient te worden hooguit een paar seconden, omdat de mitose in het embryo is zeer snel, afhankelijk van de exacte proces te bestuderen.
2. Een 3D-serie of een enkel vlak kan worden verkregen, afhankelijk van het proces van belang.
3. Voor snelwerkende remmers, de overdracht van de injectie microscoop tot imaging microscoop moet snel.

Figuur 1: Studie van de mitose in de Drosophila syncytieel embryo. Kernen in het vroege embryo ondergaan snelle divisies zonder cytokinese tijdens cycli 10 tot en met 13 kernen vormen een monolaag op de cortex. A. Schematische voorstelling van vroege embryo met de kernen op cortex. Embryo kunnen uitdrukken GFP en / of RFP gelabelde eiwitten en kan worden gemicroinjecteerd met andere gelabelde eiwitten en / of inhibitoren. B. Time lapse beeldvorming van embryo tot expressie GFP-tubuline en RFP-histon. C. Perceel van pole-pole scheiding voor fietsen 11 , 12 en 13 in een wild-type embryo. As lengte vertoont periodes van isometrische lengte en periodes van rek, die zeer consistent en reproduceerbaar zijn. D. Dynamica van spindel microtubuli. Injectie van lage concentratie van rhodamine tubuline leidt tot spikkels gevormd uit een enkele tubuline subeenheden, die kan worden gebruikt om de dynamiek van microtubuli te bestuderen.

Discussion

Dit protocol is relatief eenvoudig, maar elke stap de praktijk nodig heeft om te zorgen dat de embryo's niet beschadigd zijn. Een zorgvuldige controle-experimenten moeten altijd worden gedaan om ervoor te zorgen dat betrouwbare resultaten worden verkregen. Een goede manier om dit te beginnen is door microinjecting buffer of rhodamine tubuline in de controle-embryo's uiten van GFP-tubuline om ervoor te zorgen dat de mitose normaal verloopt door alle cycli bij de embryo oppervlak (cycli 10 tot en met 13). In controle-embryo's moet je niet een fysieke verbindingen tussen assen die vaak het gevolg zijn van teveel uitdroging te observeren, zodat lager de uitdroging tijd. Bij de embryo's beschadigd zijn, nucleaire neerslag wordt vaak waargenomen, gratis centrosomen of ongelijke afstand van kernen of spindels zijn een indicatie van schade. Percelen van pole-pole afstand zijn zeer reproduceerbaar en zijn een zeer betrouwbare maatstaf voor "succes", in control embryo's die zij moeten zien zoals die getoond in figuur 1.

We hebben gebruik gemaakt van deze protocol om vele aspecten van de assemblage van de spoel-, onderhouds-en rek met behulp van monoklonale, peptide of polyklonale antilichamen die zijn opgewekt tegen het eiwit van belang ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13} studie. Specifieke eiwit-remmers of andere chemische stoffen die het eiwit van belang kunnen ook worden gemicroinjecteerd en hun effecten waargenomen en kwantitatief gemeten. Voor de beoordeling van het effect van een bepaalde inhibitor, vergelijken we as lengte na inhibitie met dat onder controle embryo's. We kunnen ook kijken naar tubuline dynamiek door gebruik te maken Fluorescent Speckle Microscopie ¹⁴ na micro-injectie van een lage concentratie van TL-tubuline (fig. 1d).

Wij over het algemeen in te zamelen voor een uur en laat embryo's rijp voor een meer uur voor observatie, betekent dit dat embryo's tussen de 1 en 2 uur oud toen waargenomen. Als de vliegen zijn goed leggen en veel embryo's worden verzameld in een uur, dan is de collectie tijd kan zo worden verkort, dat meer synchroon-delende embryo's zijn verkregen. Als de timing van de remming is van cruciaal belang of van belang zijn voor de studie, kan de inhibitor worden geïnjecteerd onder confocale observatie. Dit is moeilijker, maar het is mogelijk toch.