Técnicas de microinjeção para estudar na Mitose Drosophila melanogaster Embrião Sincicial

Summary

Este protocolo descreve o uso de microinjeção e imagens de alta resolução na

Abstract

Este protocolo descreve o uso do embrião Drosophila melanogaster sincicial para estudar a mitose ^1. Drosophila tem uma genética útil com um genoma sequenciado, e pode ser facilmente mantido e manipulado. Mutantes mitose existem muitas, e as moscas transgênicas expressando funcional fluorescente (GFP, por exemplo) - proteínas mitótica tagged foram e estão sendo gerados. Expressão do gene alvo é possível utilizar o sistema GAL4/UAS ^2.

O embrião Drosophila cedo realiza múltiplas mitoses muito rapidamente (duração do ciclo celular, ≈ 10 min). É bem adequado para imagens de mitose, pois durante os ciclos de 10-13, os núcleos se dividem rapidamente e de forma síncrona sem intervir citocinese na superfície do embrião em uma monocamada única logo abaixo do córtex. Esses núcleos se dividem rapidamente, provavelmente, usar o aparelho mitótico mesmo que outras células, mas eles são otimizados para a velocidade, o ponto de verificação é acreditado geralmente para não ser rigoroso, permitindo o estudo de proteínas mitótica cuja ausência poderia causar parada do ciclo celular em células com um posto de controle forte . Embriões que expressam proteínas GFP rotulados quanto com microinjeção de proteínas fluorescentes rotulados podem ser facilmente visualizados para acompanhar a dinâmica ao vivo (Fig. 1). Além disso, os embriões podem ser microinjeção com função de bloqueio de anticorpos ou inibidores de proteínas específicas para estudar o efeito da perda ou perturbação da sua função ^3. Estes reagentes podem se propagar por todo o embrião, atingindo muitos fusos para produzir um gradiente de concentração de inibidor, o que resulta em um gradiente de defeitos comparável a uma série alélica de mutantes. Idealmente, se a proteína-alvo é fluorescente etiquetado, o gradiente de inibição pode ser diretamente visualizada ^4. Supõe-se que o mais forte fenótipo é comparável ao fenótipo nulo, embora seja difícil formalmente excluir a possibilidade de que os anticorpos podem ter efeitos dominante em casos raros, os controles de modo rigoroso e interpretação cautelosa deve ser aplicado. Mais longe do local da injeção, a função da proteína é apenas parcialmente perdido permitindo que outras funções da proteína-alvo para se tornar evidente.

Protocol

Receitas:

Suco de uva placas:

• 5,5 g de ágar Bacto
• 14,5 g de dextrose ou glicose
• 7,15 g de sacarose
• 45 ml suco concentrado de uva (100% suco).
• 204,5 ml H ₂ 0
• 625 mL de NaOH 10N

Misture todos os ingredientes e microondas até ferver.
Adicionar 2,8 ml de ácido mix (mistura de ácido: 20,9 ml de ácido propiônico, ácido fosfórico 2,1 ml, 27 ml H ₂ 0)

Misture e despeje em 35 milímetros pratos de Petri. Deixe solidificar à temperatura ambiente por um ou dois dias. Se as placas não vão ser usados ​​em breve, vedação com parafilme e manter a 4 ° C (deixar equilibrar à temperatura ambiente antes de usar).

Colar de levedura:

Dissolva cerca de uma colher de chá de fermento (Sigma YSC2, levedura de Saccharomyces cerevisiae tipo II) em água para formar uma pasta grossa. Coloque uma pequena quantidade deste em cada prato suco de uva pouco antes de usar.

G-PEM buffer:

• 80 mM Na-PIPES, pH 6,9
• 1 mM MgCl ₂
• 1 mM EGTA
• 1 mM GTP

Buffer de injecção:

• 150 mM K-Aspartato
• 10 mM K-fosfato
• Imidazol 20 mM, pH 7,2

Cola heptano:

Desenrole fita dupla adesiva e coloque em uma garrafa de 100ml, adicionar cerca de 50ml heptano, selar a garrafa, e rock durante vários dias. Ao usar, adicione heptano se a cola é muito grosso.

Câmara de desidratação:

Dê uma placa de Petri 100 milímetros, coloque uma parte de um prato 35 milímetros para dentro para fazer uma "mesa" e adicione Drierite (sulfato de cálcio anidro) em torno dele para que a altura de Drierite não é maior do que a "mesa" e cobertura. A lamela com embriões serão colocados nesta "tabela" para a desidratação antes da injeção. É uma boa idéia para usar pelo menos alguns Drierite indicando e alterá-lo quando ele mudou de cor.

Protocolo:

Este protocolo pode ser utilizado para a injeção de praticamente qualquer reagente solúvel no embrião Drosophila sincicial: Por exemplo, seja uma proteína fluorescente para observação ou um inibidor da proteína-alvo, ou ambos.

Ficando tudo pronto:

1 .- 2 a 3 dias antes do experimento, fazer placas de suco de uva e configurar leigos gaiola: Pegue uma garrafa de plástico (6 oz, fundo redondo de Drosophila Científica Aplicada), corte dois pequenos furos (cerca de 1cm ²⁾ em lados opostos do garrafa e preencha com um pedaço de algodão (o que permitirá que o fluxo de ar), toque as moscas dentro da garrafa e cubra com uma placa de suco de uva. Mantenha a 25 ° C (ou à temperatura ambiente), as moscas devem estabelecer embriões para cerca de 10 dias.

2 .- Pelo menos um dia antes do experimento puxar agulhas para injeção, usamos uma agulha Kopf / Pipetar modelo extrator 720 e finos filamentos de vidro paredes (Precision Instruments tw100f Mundial). Para injeção de tubulina fluorescentes, manter agulhas a 4 ° C para evitar induzidas pela temperatura de polimerização na agulha.

Preparação tubulina:

Nota: Todos os trabalhos com tubulina deve ser feito a 4 ° C para evitar a polimerização.

1. Tome tubulina rotulados fora do congelador e colocá-lo em gelo durante 5 a 15 minutos.
2. Diluir com G-PEM tampão (4 a 10 vezes, dependendo da intensidade necessária).
3. Centrifugar a 13k rpm a 4 ° C por 10-15 minutos.
4. De carga 1 - 2 l na agulha.

Anticorpo ou inibidor químico:

Prepare agulhas como para tubulina, usando uma concentração adequada (isto pode precisar de ser testado). O anticorpo pode ser em tampão de injeção, G-PEM buffer ou PBS. Se outro buffer é necessária, esse buffer terá de ser injetado como um controle para garantir que este tampão não causa nenhum dano por conta própria.

Nota: tubulina Inibidor e fluorescentes podem ser misturados e injectados em conjunto, se as concentrações permitem. Caso contrário, injetar o tubulina fluorescentes e esperar 5 a 10 minutos antes de injetar o inibidor. Ao realizar uma injeção dupla, comece com mais embriões, uma vez que menos embriões irá recuperar normalmente.

De colheita de embriões:

1. Colocar uma placa de suco de uva novo na gaiola leigos.
2. Remover esta placa, após uma hora, esta é a primeira coleção do dia e muitas vezes não é muito bom. Ele pode ser descartado.
3. Mudar a placa a cada hora para manter embriões coleta de uma hora cada.

Preparação lamela:

1. Coloque uma lamela 50 x 22 milímetros em um lado de uma lâmina de microscópio. Tape os quatro cantos para o slide para que ele não se move.
2. Usando um aplicador derrubado algodão, coloque uma camada de cola heptano em uma única linha sobre a lamela (a cola não deve ser viscoso e deve secar em poucos segundos, caso contrário, adicionar mais heptano).
3. Coloque um pedaço dedupla fita adesiva sobre o slide para o lado da lamela.

Preparação embrião:

Nota: Os embriões devem ser visualizados cerca de 2 horas após o início da coleta, para começar os seguintes passos permitindo tempo suficiente para terminá-los dentro desse espaço de tempo.

1. Com um pincel umedecido com cuidado pegar os embriões da placa de suco de uva e coloque em fita adesiva dupla no slide.
2. Usando a parte exterior das pinças, rolar os embriões sobre a fita adesiva dupla até o córion (membrana externa) se rompe.
3. Pegue o embrião de suavemente ondulado-lo sobre o córion assim que adere à pinça e colocá-lo na cola heptano na lamela com o lado longo do paralelo de embriões para o lado longo da lamela. Conjunto de 10 a 20 embriões em uma linha.
4. Retirar as lamelas e colocá-lo na câmara de desidratação de 3-8 minutos (isso depende da umidade da sala ea quantidade a ser injetada).
5. Coloque em uma câmara metálica com graxa de vácuo.
6. Cobrir os embriões com 700 halocarbono óleo para evitar uma maior desidratação. Embriões já estão prontos para injeção.

Injeção de embrião:

1. Pesquisar os embriões em um objetivo 16x.
2. Mover os embriões de distância, e encontrar a agulha sem mover o plano focal.
3. Centro de agulha e movê-lo sem movê-lo na direção x ou y.
4. Se a agulha não estiver aberto, colocar a ponta da lamela no campo de visão, mas não onde a agulha será, e inferior a agulha para o mesmo plano focal. Com muito cuidado mover a lamela até atingir a agulha e delicadamente quebra-la aberta. Se a agulha estiver aberto, vá para o passo 5. (As agulhas podem ser abertos com ácido fluorídrico antes de preencher).
5. Colocar os embriões em ver (mas não onde a agulha será), menor a agulha no óleo e certifique-se de obter gotas de líquido agradável da agulha.
6. Com cuidado mas firmemente mover o embrião para a agulha e injetar uma gota no embrião e mover o embrião de distância. (Ou siga as instruções do seu aparelho de injecção).
7. Depois de todos os embriões foram injetados, eles estão prontos para observação em um microscópio confocal.

Imagem:

Imagem os embriões em um microscópio confocal com um objetivo de 60 ou 100 vezes:
Notas:

1. O intervalo de tempo em uma série de lapso de tempo deve ser no máximo alguns segundos, uma vez que a mitose no embrião é muito rápido, dependendo do processo exato a ser estudado.
2. Uma série 3D ou um único plano pode ser adquirido, dependendo do processo de interesse.
3. Para os inibidores de ação rápida, a transferência do microscópio de injeção para microscópio de imagem tem que ser rápido.

Figura 1: Estudo da mitose no embrião Drosophila sincicial. Núcleos no embrião sofrer divisões rápida sem citocinese, durante os ciclos de 10 a 13 núcleos formam uma monocamada no córtex. A. Esquemática do embrião com núcleos no córtex. Embrião pode expressar GFP e / ou RFP proteínas e pode ser rotulada microinjeção com outras proteínas rotuladas e / ou inibidores. B. imagem lapso de tempo de embrião expressando GFP-tubulina e RFP-histonas. Plot C. do pólo-pólo de separação para ciclos de 11 , 12 e 13 em um embrião de tipo selvagem. Comprimento do eixo apresenta períodos de duração isométrica e períodos de alongamento, que são muito consistentes e reprodutíveis. Dynamics D. dos microtúbulos do fuso. Injeção de baixa concentração de tubulina rodamina leva a manchas formadas por subunidades de tubulina poucos, o que pode ser usado para estudar a dinâmica de microtúbulos.

Discussion

Este protocolo é relativamente simples, no entanto, cada etapa requer prática para se certificar de que os embriões não estão danificados. Experimentos de controle cuidadoso sempre precisa ser feito para garantir que os resultados estão sendo obtidos confiável. Uma boa maneira de começar isso é microinjecting tubulina buffer ou rodamina em embriões de controle expressando GFP-tubulina para se certificar de que a mitose prossegue normalmente através de todos os ciclos na superfície do embrião (ciclos de 10 a 13). Em embriões de controle que você não deve observar qualquer conexão física entre eixos, que são muitas vezes o resultado de desidratação muito, então diminuir o tempo de desidratação. Quando os embriões sejam danificados, fallout nuclear é muitas vezes observada, centrossomas livre ou espaçamento desigual de núcleos ou eixos são indicativos de danos. Parcelas da pole pole distância são muito reprodutíveis e são uma medida muito confiável de "sucesso", em embriões de controle que eles devem olhar como as mostradas na figura 1.

Nós temos usado esse protocolo para estudar vários aspectos da manutenção do eixo, montagem e alongamento utilizando monoclonal, os anticorpos policlonal peptídeo ou levantadas contra a proteína de interesse ^{1,5,6,7,8,9,10,11,12,13.} Inibidores da proteína específica ou outros produtos químicos que afetam a proteína de interesse também pode ser microinjeção e seus efeitos observados e medidos quantitativamente. Para avaliar o efeito de um inibidor particular, nós comparamos comprimento do veio após a inibição ao observado em embriões controle. Nós também podemos olhar para a dinâmica tubulina usando Microscopia fluorescente Speckle ¹⁴ após microinjeção de uma baixa concentração de tubulina fluorescentes (Figura 1d).

Nós geralmente recolher para uma hora e deixe embriões maduros para mais uma hora antes da observação, isto significa que os embriões são entre 1 e 2 horas de idade, quando observado. Se as moscas estão colocando bem e muitos embriões são coletados em uma hora, então o tempo de coleta pode ser reduzido para que mais embriões síncrona dividindo-são obtidos. Se o tempo de inibição é crítico ou de interesse para o estudo, o inibidor pode ser injetado sob observação confocal. Isso é mais difícil, mas é possível, no entanto.