Summary
In deze video voeren we electrogram opname, oogzenuw opnemen en intraretinal opnemen met de Amerikaanse hoefijzer krab,
Abstract
De Amerikaanse degenkrab, Limulus Polyphemus is een van de oudste wezens op aarde, en het dier blijft spelen een onmisbare rol in biomedisch onderzoek. Niet alleen hun bloed bevat speciale cellen die wetenschappers gebruiken om bacteriotoxins op te sporen in onze geneesmiddelen, maar hun ogen bevatten ook een neuraal netwerk dat heeft veel inzicht over de fysiologische processen die actief zijn in ons visuele systeem, zoals licht aanpassing en laterale inhibitie. De degenkrab blijft een aantrekkelijk model voor de visie onderzoek, omdat het dier is groot en winterharde voor een ongewerveld, zijn netvlies neuronen zijn groot en gemakkelijk bereikbaar, het visuele systeem is compact en uitgebreid bestudeerd, en de visuele gedrag is goed gedefinieerd. Bovendien is de structuur en functie van de ogen worden gemoduleerd op een dagelijkse basis door een circadiane klok in de hersenen van het dier is. In het kort, het visuele systeem van de hoefijzer krabben is eenvoudig genoeg is om nog te begrijpen complex genoeg om interessant zijn.
In deze video geven we drie elektrofysiologische paradigma's voor het onderzoek naar de neurale basis van de visie dat kan in vivo worden uitgevoerd met Limulus. Ze zijn electrogram opname, oogzenuw opnemen en intraretinal opname. Electroretinogram (ERG) opnames te meten met een oppervlakte elektrode de opgetelde elektrische respons van alle cellen in het oog met een flits van licht. Ze kunnen worden gebruikt om de algemene gevoeligheid van het oog voor de verlenging van tijd te controleren. Oogzenuw opnames meten de stekelige activiteit van enkele zenuw vezels met een extracellulair microsuction elektrode. Ze kunnen worden gebruikt om visuele boodschappen van het oog naar de hersenen als circadiane klok berichten teruggekoppeld van de hersenen naar de ogen te bestuderen. Intraretinal opnames meten met een intracellulaire micro-elektrode de spanningsschommelingen veroorzaakt door het licht in de individuele cellen van het oog. Ze kunnen worden gebruikt om cellulaire mechanismen van het netvlies verwerking toe te lichten.
Protocol
Deel 1: Experimentele Voorbereiding
Experimentele procedures uitgevoerd op hoefijzer krabben zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Boston University. Dieren zijn gekocht van de Marine Biological Labs (Woods Hole, MA) of een andere leverancier en gehuisvest in een beluchte zoutwater tank in een ruimte blootgesteld aan een gereglementeerde licht-donker cyclus. De verlichting regime is van belang voor entraining van de krab circadiane klok en fietsen in het oog dagelijks tussen de dag en nacht staten. Onmiddellijk voor aanvang van alle invasieve procedures, is het dier gekoeld in een ijsemmer gedurende 10-15 minuten totdat de beweging wordt afgeremd en vervolgens aan een houten platform met twee roestvrij stalen schroeven ingebracht in de prosoma en twee in de opisthosoma. Het platform is onder verzwaard met graniet, zodat het zinkt in water. Na terminal experimenten het dier wordt gedood door onderdompeling in ijs slurry weer en pithing de hersenen, die ligt boven de mond, met een scalpel.
Deel 2: Oplossingen
Limulus Ringer-oplossing bestaat uit 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM HEPES, en 10 ml / L Pen-Strep mix (penicilline-streptomycine, 10.000 eenheden / ml) .
Deel 3: electrogram opnemen
Gereedschappen die nodig zijn voor deze procedure onder meer een schroevendraaier, vaseline, Ringer's oplossing, een transfer pipet, een groene LED, een opname kamer, roestvrij stalen schroeven, en een wattenstaafje.
- Een handgemaakte kamer wordt gebruikt om de ERG (Figuur 1A) vast te leggen. De kamer lichaam is ontworpen om een zoutoplossing reservoir te houden in contact met de ogen. Het deksel bevat een zilverchloride draad voor het koppelen van de geleidende oplossing voor een versterker en een klein gaatje formaat om een LED tegemoet te komen. Een Ultrabright LED met een piek rond 520nm-uitstoot het beste werkt.
- Om te beginnen, is de onderkant van de kamer bedekt met vaseline en vastgezet over het oog met twee schroeven.
- De kamer wordt vervolgens gevuld met zoutoplossing en afgedekt met het deksel.
- Na de kamer bevestiging van de krab wordt geplaatst in een lichtdichte kooi in een tank gevuld met zeewater over de kieuwen.
- De LED-kabel is aangesloten op de kamer deksel.
- Het signaal wordt afgekapt leiden tot het chloride draad, en de referentie-lood wordt afgekapt tot een van de geïmplanteerde schroeven.
- Beide leads zijn aangesloten op het hoofd podium van een hoge impedantie differentiële versterker (X-cell 3x4, FHC Inc) voor signaalversterking en de versterker filter is ingesteld om de frequenties te gaan onder de 10Hz.
- De versterker uitgang wordt gevoed aan een oscilloscoop voor het bekijken en om een data-acquisitie board voor computer-analyse en opslag.
- Na de installatie van de kooi deur gesloten is om ruimte te licht te blokkeren van het bereiken van het dier.
- De gegevens worden verzameld met een aangepast programma geschreven in LabVIEW. Het programma knippert de LED, registreert de opgeroepen ERG-signaal, en meet de piek-piek amplitude response. De keuze van de flash paradigma hangt af van de experimentele doelstelling. Bijvoorbeeld, een korte (100ms) pols van 5V toegepaste elke 10 minuten naar de LED voorkomt effecten van licht adaptatie bij de monitoring van circadiane veranderingen in het oog gevoeligheid.
Deel 4: Optische zenuw-opname
Gereedschappen die nodig zijn voor deze procedure onder meer een schroevendraaier, draad, een trephine, Ringer's oplossing, rongeurs, vannas schaar, een opname kamer, gebogen tang, fijne naald probes, een doffe scalpel, chirurgische scharen, en een zuig-elektrode.
- Een handgemaakte kamer wordt gebruikt om de oogzenuw reacties (Figuur 1B) record. Het interieur van de kamer is 2 cm diameter openen goed dat een dunne sleuf halfronde opening in de bodem muur om de zenuw huisvesten en te isoleren uit het omringende weefsel is.
- Voordat kamer bevestiging een 16-gauge naald wordt ingevoegd tussen het scharnier spieren in het hart en ~ 20CC van bloed wordt afgetapt van het dier. Verbloeding is niet noodzakelijk maar maakt oogzenuw dissectie gemakkelijker.
- De locatie van de oogzenuw wordt geschat door te putten uit het schild een licht gebogen lijn tussen de laterale en mediane ogen.
- Een ronde gat wordt vervolgens gesneden in het schild met een trephine. Het gat is dezelfde diameter heeft als de kamer ook. Het centrum van het gat bevindt zich 2-3 cm anterieur van de laterale oog en iets dorsaal van de lijn, zodat de zenuw loopt langs de ventrale deel van de put.
- Bindweefsel is gewist totdat de zenuw is volledig zichtbaar en vrij van de omringende en onderliggende weefsel.
- Een streng van de draad is een lus rond de zenuw en trok in de kamer door de sleuf aan de onderkant. Door deze zelfde openen van de zenuw wordt voorzichtig geleid in de kamer door te trekken aan het touw. Tegelijkertijd is de kamer goed is in het gat. De kamer wordt dan aangebracht op het schildmet schroeven en de put is gevuld met Ringer's.
- Na de kamer bevestiging van het dier wordt geplaatst in een lichtdichte kooi in een tank gevuld met zeewater over de kieuwen.
- Het goed wordt gevisualiseerd in een stereoscoop (SMZ-168, Jed Pella Inc) en katoen is gevoerd rond de opening in de bodem om lekkage van bloed te voorkomen in en zout uit de kamer.
- Residuele bindweefsel rond de zenuw wordt verwijderd met een fijne schaar en pincet, en de kamer is gevuld met de oplossing verse Ringer's.
- Een nick is gemaakt in het bloedvat dat de zenuw omhult en door deze opening de zenuw wordt zorgvuldig desheathed in de lengte met behulp van fijne schaar, pincet, naald en sondes.
- Een klein vezelbundel is gescheiden van de zenuw met behulp van de sonde en snijd aan het eind het verst van het oog voor afferente vezels opnemen en aan het einde het dichtst bij het oog voor efferente vezels opnemen. In de video het einde voor afferente vezel-opnames is te snijden.
- Een microsuction elektrode (AM Systems Inc) gevuld met Ringers oplossing wordt gebruikt voor optische zenuw opname. De elektrode tip is gemonteerd op de zenuw bundel door het vuur het polijsten van het einde van een 1 mm diameter borosilicaatglas capillair.
- De elektrode tip is neergelaten in de kamer goed met een handmatige manipulator (WPI Inc), en de snede vezelbundel wordt meegezogen in de tip. Afzuiging wordt verzorgd door een Gilmont spuit is aangesloten op de elektrode via de slang.
- Een BNC-aansluiting geeft de signaal lood en een zilverchloride draad gewikkeld rond de elektrode om ruis te verminderen geeft de referentie te leiden. De twee leads zijn aangesloten op het hoofd podium van een differentiële versterker voor signaalversterking en geluid filtering (X-cell 3x4, FHC Inc). De versterker uitgang wordt gestuurd naar een oscilloscoop voor het bekijken en een data-acquisitie kaart voor de computer analyse en opslag.
- De gegevens worden verzameld met een aangepast programma geschreven in LabVIEW. Het programma controleert lichtprikkels via een digitale video-processor (bits + +, Cambridge Research Systems Inc) en interfaces met een digitale spike discriminator (APM, FHC Inc), die spike treinen records. Licht kan worden geleverd aan enkele cellen in het oog via een glasvezel licht buis of op het gehele oog via een computer-gestuurde video weer te geven.
Deel 5: Intraretinal opname
Gereedschappen die nodig zijn voor deze procedure onder meer een schroevendraaier, een L-vormige Lucite platform met schroefdraad schroefgaten, een micro-elektrode houder met een glazen pipet, roestvrij stalen schroeven, pincet, scalpel en een boete.
- Een handgemaakte Lucite plaat met vooraf ingestelde schroefgaten wordt gebruikt om de intracellulaire responsen op te nemen. De gaten zijn verdeeld voor het monteren van een gemotoriseerde micromanipulator (PPM5000, WPI Inc). De plaat is aan het dier bevestigd met twee schroeven aan de zijkant en een op de top.
- Na de plaat bevestiging van het dier wordt geplaatst in een lichtdichte kooi in een tank gevuld met zeewater over de kieuwen.
- De micropositioner is geschroefd in de plaat, met zijn beweegbare arm uitgelijnd over het oog.
- Een partij van glas micropipetten worden getrokken van 1-mm OD borosilicaat glas en de tips zijn opgevuld via capillaire werking door het plaatsen van de micropipetten in een klein flesje van 3M KCl oplossing.
- De rest van de pipetten zijn vervolgens handmatig gevuld met de zoutoplossing en ingebracht in een electrode houder.
- De elektrode houder is verbonden met de hoofd fase van een intracellulaire versterker (IR-283, Cygnus Technology Inc) aangebracht op het micropositioner arm.
- Een klein deel van de retina (~ 1mm2) wordt blootgesteld door het wegsnijden van de cornea-interface met een scheermesje.
- Een druppel van de oplossing Ringer is geplaatst op de blootgestelde netvlies te drogen te voorkomen en de micropipet tip is gevorderd door de opening in retinaal weefsel.
- Wanneer de tip van de oplossing komt, wordt de huidige injectie modus van de intracellulaire versterker ingeschakeld en elektrode impedantie is gemeten. Micropipetten met een impedantie buiten het bereik van 20-70 MW worden verwijderd. Die in dit assortiment zijn gevorderd in micron stappen en gespietst in de cellen door het vibreren van de pipetpunt elektronisch of mechanisch.
- Drie typen cellen kunnen worden aangetroffen in het oog. Retinular cellen laten slechts een depolariserende reactie op licht, excentrieke cellen vertonen een trein van actiepotentialen rijden op een depolariserende respons, en pigment cellen vertonen geen licht reactie.
- De gegevens worden verzameld met een aangepast programma geschreven in Labview. Het programma controleert lichtprikkels via een digitale video-processor (bits + +, Cambridge Research Systems). De stimuli worden geleverd aan gespietst cellen met een glasvezel pijp of beeldscherm. Spanning reacties worden waargenomen op de oscilloscoop en gedigitaliseerd door het programma naar de computer.
Deel 6: representatieve resultaten
Een vertegenwoordiger ERG is weergegeven in figuur 2A. De golfvorm geeft de opgetelde elektrischereactie op licht van vooral de photoreceptive retinular cellen, zijn zij zeer talrijker zijn dan de excentrieke cellen en elektrisch gekoppeld. Er zijn niet meerdere golfvorm componenten van verschillende celtypes het netvlies als bij de zoogdieren ERG. Circadiane feedback van een klok in de hersenen Limulus moduleert de fysiologische eigenschappen van het netvlies cellen op een dagelijkse basis, waardoor de amplitude en tijdsverloop van de ERG te variëren in de tijd (1). Zoals getoond in Figuur 2B, ERG amplitude is het hoogst tijdens de subjectieve van het dier 's nachts en het laagst tijdens de subjectieve dag.
Een vertegenwoordiger spoor van een enkele optische zenuwvezel reactie op licht is weergegeven in figuur 3. Excentrieke cellen gedragen zich al ongeveer hetzelfde, met een tijdelijke verhoging van de piek debiet, gevolgd door een verval naar een constant hoog niveau. Het tarief verval weerspiegelt de gecombineerde werking van het licht aanpassing en spike-afhankelijke self-remming op excentrieke cellen (2). Andere spike patronen, zoals licht-afhankelijke afname van de snelheid, zijn gezien in de Limulus hersenen, maar niet in het oog (3).
Representatief zijn sporen van de spanning reactie van een pigment cel, retinular cel en excentrieke cel aan het licht zijn weergegeven in figuur 4. Alleen de laatste twee netvlies celtypen zijn visueel. De amplitude en de tijd loop van hun reactie hangt af van de kwaliteit van de opname en de locatie van de elektrode in de cel. Meestal is de elektrode dringt pigment cellen of retinular cellen vanwege hun grote omvang en aantal. In het laatste geval een tijdelijke depolarisatie dat vervalt tot een constant hoog niveau is opgenomen. Het verval is te wijten aan het licht adaptatie door retinular cellen (2). Als de elektrode komt een excentriek cel, zijn grote actiepotentialen geregistreerd in het axon (40-70mV) en kleine actiepotentialen rijden op een depolariserende golfvorm (<25mV) bij de soma.
Figuur 1. Schematische diagrammen van kamers gebruikt voor electroretinogram opname (A) en de optische zenuw-opname (B). Bar is gelijk aan 7mm in A en 5mm in B.
Figuur 2. Voorbeeld spoor van een Limulus ERG opgeroepen door een LED-100ms puls van 5V in het donker (A) en de piek-piek fluctuatie in ERG amplitude loop van de tijd in constante duisternis (B). Duisternis is een initiatief op dat moment aangegeven door de witte driehoek. De groei van de ERG amplitude door de tijd aangegeven door de zwarte driehoek is te wijten aan het licht aanpassing, die gevoelige ogen toeneemt in het donker. De cyclische variatie in ERG amplitude is daarna door interne het dier circadiane klok. Tijdstippen in B zijn elke 5min.
Figuur 3. Voorbeeld spoor van een oogzenuw vezel reactie op licht flitste op een enkele ommatidial receptor. Golfvorm boven het trace laat zien stimulus timing. Excentriek cellen, waarvan axonen aanleiding geven tot zenuwvezels, alle tonen een vergelijkbaar patroon van stoken, omdat dit onder de verlichting voorwaarden van het experiment (5sec flash in totale duisternis). Retinale codering met spikes is een eigenschap Limulus gemeen heeft met de zoogdieren, in tegenstelling tot andere ongewervelden.
Figuur 4 Voorbeeld sporen van de spanning reactie op licht van de drie soorten cellen aanwezig zijn in de Limulus laterale oog:. Pigment cellen (A), retinular cel (B), en de excentrieke cel (C). De eerste cel is niet-visuele. De laatste twee depolariseren op een lichtflits. De depolarisatie is het grootst voor retinular cellen, omdat ze transduceren het licht en stuurt het signaal via gap junctions de excentrieke cel, met enig verlies langs de weg. In de excentrieke cel worden actiepotentialen afgevuurd door de axon zien rijden op de depolarisatie te wijten aan spike backpropagation in de soma. De amplitude van actiepotentialen is afgezwakt in de figuur voor een betere weergave van de depolariserende potentieel. De rustpotentiaal van de cellen is-50mV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben geïllustreerd hoe ERG opnames, oogzenuw opnamen en intraretinal opnamen op hoefijzer krabben in vivo uit te voeren. De opname technieken die elk bieden verschillende inzichten in de neurale basis van visie, en ze kunnen allemaal worden gebruikt om de functie van de retina in levende dieren, dankzij de grote van de krab in de ogen en de harde rugschild te bestuderen. Oogzenuw activiteit kan zelfs worden opgenomen van vrij gedragen dieren in de oceaan met de juiste constructie van de elektroden (4). Deze technieken kunnen ook worden uitgevoerd op weggesneden ogen met kleine wijziging van de setup. De relevantie van dergelijke experimenten om de natuurlijke toestand zou worden beperkt, omdat de fysiologische eigenschappen van het oog van de krab te veranderen bij het verwijderen van het dier (5), maar de educatieve waarde zou geweldig zijn voor een leer lab, gezien de wijdverbreide gebruik van deze methoden in neurowetenschappen.
ERG opname, oogzenuw opnemen en intraretinal opname werden afzonderlijk hier gepresenteerde ter wille van de duidelijkheid. In de praktijk zijn meerdere opname methoden vaak gecombineerd in een enkel experiment gelijktijdig te volgen veranderingen in de neurale activiteit en visuele gevoeligheid in een of beide laterale ogen. De kleine kamer die we gebruiken voor het ERG opname is bijzonder voordelig in dit verband ten opzichte van andere modellen (1, 6). Bovendien heeft een reservoir van een zout-oplossing die is afgesloten van de lucht, waardoor de stabiliteit problemen in verband met de conventionele lont elektroden die kunnen uitdrogen na verloop van tijd. De suite van mogelijke visie experimenten met Limulus is nog groter dan dit, omdat het dezelfde procedures beschreven voor zenuw-registratie kan worden toegepast voor zenuwstimulatie door het aansluiten van de elektrode leidt tot een elektrische stimulator in plaats van een signaalversterker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Birgit Werner erkennen voor haar hulp bij het produceren van deze video artikel. Dit onderzoek werd gefinancierd door een NSF Career Award.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| LED | Light source | Newark Inc | 33C1292 | |
| Suction electrode | Electrode | A-M Systems | 573000 | |
| XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier | Amplifier | FHC, Inc. | 40-40-8B | |
| Intracellular Recording | Amplifier | Cygnus | IR-283A | |
| APM | Neural Spike Discriminator | FHC, Inc. | APM | |
| Bits++ | Video Board | Cambridge Research Systems | Bits++ | |
| Piezopatch Manipulator | Micropositioner | World Precision Instruments, Inc. | PPM5000 | |
| Square Pulse Stimulator | Nerve Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Borosilicate Glass Capillary | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Horsesh– crab (Limulus polyphemus) | Animal | Marine Biological Laboratories | ||
| Micropipette Puller | Glass Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Zoom Stereoscope | Microscope | Jed Pella Inc. | SMZ-168 |
References
- Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
- Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
- Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
- Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
- Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
- Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).
