Summary
In questo video possiamo eseguire la registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica con il granchio americano a ferro di cavallo,
Abstract
Il granchio americano a ferro di cavallo, Limulus Polifemo è una delle più antiche creature sulla terra, e l'animale continua a svolgere un ruolo indispensabile nella ricerca biomedica. Non solo il loro sangue contiene cellule speciali che gli scienziati utilizzano per rilevare bacteriotoxins nei nostri farmaci, ma i loro occhi contengono anche una rete neurale che ha fornito informazioni molto di processi fisiologici che operano nel nostro sistema visivo, come ad esempio l'adattamento alla luce e l'inibizione laterale. Il granchio a ferro di cavallo rimane un modello interessante per la ricerca visione perché l'animale è grande e resistente per un invertebrato, i suoi neuroni della retina sono grandi e facilmente accessibili, il suo sistema visivo è compatto e ampiamente studiato, e il suo comportamento visivo è ben definito. Inoltre, la struttura e la funzione degli occhi sono modulati su una base quotidiana da un orologio circadiano nel cervello l'animale s. In breve, il sistema visivo dei granchi a ferro di cavallo è abbastanza semplice da essere capito ancora abbastanza complessa per essere interessante.
In questo video vi presentiamo tre paradigmi elettrofisiologico per indagare le basi neurali della visione che possono essere eseguite in vivo con Limulus. Sono registrazione elettroretinogramma, la registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica. Elettroretinogramma (ERG) registrazioni misura con una superficie dell'elettrodo la risposta elettrica riassunto di tutte le cellule negli occhi un lampo di luce. Possono essere utilizzati per monitorare la sensibilità complessiva del occhio per prolungare i periodi di tempo. Registrazioni nervo ottico misurare l'attività incurvamento singole fibre nervose con un elettrodo extracellulare microsuction. Possono essere utilizzati per studiare messaggi visivi trasmessi dall'occhio al cervello e-orologio circadiano messaggi reinserito dal cervello alla vista. Intraretinica misura registrazioni con microelettrodi intracellulari le fluttuazioni di tensione indotta dalla luce in singole cellule dell'occhio. Possono essere usati per chiarire i meccanismi cellulari di elaborazione della retina.
Protocol
Parte 1: Preparazione Sperimentale
Procedure sperimentali eseguite su granchi a ferro di cavallo sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Boston University. Gli animali vengono acquistati dai laboratori di biologia marina (Woods Hole, MA) o altri fornitori e ospitato in una vasca con acqua di mare aerata in una stanza esposta a un mercato regolamentato ciclo luce-buio. Il regime di illuminazione è importante per inglobamento orologio circadiano del granchio e il ciclismo l'occhio ogni giorno tra i suoi stati diurno e notturno. Immediatamente prima di iniziare qualsiasi procedura invasiva, l'animale è raffreddata in un secchiello del ghiaccio per 10-15 minuti fino a quando il suo moto è rallentato e poi fissato a una piattaforma di legno con due viti in acciaio inox inserito nel Prosoma e due nella opisthosoma. La piattaforma è ponderata sotto con granito in modo che affonda in acqua. Dopo gli esperimenti terminale l'animale è eutanasia mediante immersione in liquami ghiaccio di nuovo e enervazione il cervello, che si trova sopra la bocca, con un bisturi.
Parte 2: Soluzioni
Soluzione Limulus Ringer è composto di 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50 micron TES, HEPES 50 micron, e 10 ml / L Pen-Strep mix (penicillina-streptomicina, 10000 unità / ml) .
Parte 3: Registrazione Elettroretinogramma
Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, vaselina, soluzione di Ringer, una pipetta di trasferimento, un LED verde, una camera di registrazione, viti in acciaio inox, e un tampone di cotone.
- Una camera a mano è usato per registrare il GRE (Figura 1A). Il corpo camera è progettata per contenere un bacino salino in contatto con l'occhio. Il coperchio contiene un filo di cloruro d'argento per l'accoppiamento la soluzione conduttiva ad un amplificatore e un foro di piccole dimensioni per ospitare un LED. Un LED ultraluminosi con picco di emissione intorno 520nm funziona meglio.
- Per iniziare, la parte inferiore della camera è rivestita con vaselina e fissato sopra l'occhio con due viti.
- La camera viene poi riempito con soluzione fisiologica e sigillato con il coperchio.
- Dopo l'attaccamento camera il granchio è collocato in una tenuta di luce gabbia in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie.
- Il cavo LED è inserito nel coperchio della camera.
- Il cavo segnale viene troncato per il filo cloruro, e la guida di riferimento è ritagliato una delle viti impiantate.
- Entrambi i cavi sono collegati alla fase a capo di un amplificatore ad alta impedenza differenziale (X-cell 3x4, FHC Inc) per l'amplificazione del segnale e il filtro amplificatore è impostato per passare le frequenze inferiori a 10Hz.
- L'uscita dell'amplificatore è inviato a un oscilloscopio per la visualizzazione e ad una scheda di acquisizione dati per l'analisi del computer e lo stoccaggio.
- Dopo l'installazione la porta della gabbia è chiusa per bloccare la luce della stanza di raggiungere l'animale.
- I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in LabView. Il programma lampeggia il LED, registra il segnale evocato ERG, e misura il picco-picco di ampiezza di risposta. La scelta del paradigma flash dipende l'obiettivo sperimentale. Ad esempio, un breve (100 ms) impulso di 5V applicata ogni 10 minuti per il LED di evitare effetti di adattamento alla luce quando il monitoraggio dei cambiamenti circadiano della sensibilità dell'occhio.
Parte 4: la registrazione del nervo ottico
Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, filo, un trapano, soluzione di Ringer, Rongeurs, forbici Vännäs, una camera di registrazione, pinze curve, sonde con ago sottile, un sordo bisturi, forbici chirurgiche, e un elettrodo di aspirazione.
- Una camera a mano è usato per registrare le risposte del nervo ottico (Figura 1B). L'interno della camera di due centimetri di diametro è ben aperta che ha una sottile apertura semicircolare fessura nella parete di fondo per accogliere il nervo e isolare dal tessuto circostante.
- Prima di attaccamento camera di un 16-gauge viene inserito tra i muscoli cerniera nel cuore e ~ 20 cc di sangue drenato dal animale. Dissanguamento non è necessario ma rende più facile la dissezione del nervo ottico.
- La posizione del nervo ottico è stimato da disegno sul carapace di una linea leggermente curva tra gli occhi laterali e mediana.
- Un foro circolare viene poi tagliata nel carapace con un trapano. Il foro è lo stesso diametro della camera di bene. Il centro del buco si trova 2-3 cm anteriore dell'occhio e leggermente laterale dorsale per la linea in modo che il nervo corre lungo la parte ventrale del bene.
- Tessuto connettivo è cancellato fino a quando il nervo è completamente visibile e priva di tessuto circostante e sottostante.
- Un filo di thread è passato intorno al nervo e tirò nella camera attraverso la fessura in basso. Attraverso questa stessa apertura il nervo viene delicatamente guidato nella camera tirando la corda. Allo stesso tempo, la camera è ben inserito nel foro. La camera è quindi fissata al carapacecon viti e il pozzo è riempito con soluzione di Ringer.
- Dopo l'attaccamento della camera l'animale è posto in una gabbia a tenuta di luce in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie.
- Il pozzo è visualizzato sotto uno stereoscopio (SMZ-168, Jed Pella Inc) ed è imbottita di cotone attorno l'apertura sul fondo per evitare la fuoriuscita di sangue e soluzione salina dalla camera.
- Residua del tessuto connettivo intorno al nervo viene rimosso con forbici e pinzette, e la camera è riempita con soluzione di Ringer fresco.
- Un nick è presentata nel vaso sanguigno che incapsula il nervo e attraverso questa apertura il nervo viene attentamente desheathed tutta la sua lunghezza con le forbici fine, pinzette, aghi e sonde.
- Un piccolo fascio di fibre è separata dal nervo utilizzando la sonda e tagliare alla fine più lontana dagli occhi per la registrazione delle fibre afferenti e alla fine più vicino agli occhi per la registrazione delle fibre efferenti. Nel video la fine per le registrazioni di fibre afferenti viene tagliato.
- Un elettrodo microsuction (AM Systems Inc) riempita con una soluzione Ringers è utilizzato per la registrazione del nervo ottico. La punta dell'elettrodo è montato il fascio nervo dal fuoco lucidatura alla fine di un vetro borosilicato 1 millimetro di diametro capillare.
- La punta dell'elettrodo si abbassa nella camera bene con un manipolatore manuale (WPI Inc), e il fascio di fibre taglio è risucchiato la punta. Aspiratore è dotato di una siringa Gilmont collegato all'elettrodo attraverso tubi.
- Una connessione BNC fornisce il cavo del segnale e un filo di cloruro d'argento avvolto intorno all'elettrodo per ridurre il rumore fornisce la guida di riferimento. I due cavi sono collegati alla fase a capo di un amplificatore differenziale per l'amplificazione del segnale e rumore di filtraggio (X-cell 3x4, FHC Inc). L'uscita dell'amplificatore è inviato ad un oscilloscopio per la visualizzazione e una scheda di acquisizione dati per l'analisi del computer e lo stoccaggio.
- I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in LabView. Il programma controlla stimoli luminosi tramite un processore video digitale (bit + +, Cambridge Research Systems Inc) e le interfacce con un picco digitale discriminatore (APM, FHC Inc) che registra treni di impulsi. La luce può essere consegnato a singole cellule negli occhi attraverso un tubo di illuminazione a fibre ottiche o per l'intero occhio attraverso un controllo computerizzato di visualizzazione video.
Parte 5: registrazione intraretinica
Strumenti necessari per questa procedura sono un cacciavite, una a forma di L piattaforma lucite con fori filettati, titolare di un microelettrodo con una pipetta di vetro, viti in acciaio inox, pinzette e un bisturi sottile.
- Un piatto a mano lucite con fori per le viti preset viene utilizzato per registrare le risposte intracellulari. I fori sono distanziati per il montaggio di un micromanipolatore motorizzato (PPM5000, WPI Inc). La piastra è fissata per l'animale con due viti sul lato e uno sopra.
- Dopo l'attaccamento piastra l'animale è posto in una gabbia a tenuta di luce in una vasca riempita con acqua di mare sopra le branchie.
- Il micropositioner è avvitato il piatto, con il suo braccio mobile allineati sopra l'occhio.
- Un lotto di micropipette di vetro sono tirati da 1-mm di diametro in vetro borosilicato e le punte sono riempito attraverso un'azione capillare mettendo il micropipette in una fialetta di soluzione di KCl 3M.
- Il resto del pipette vengono riempite manualmente con la soluzione salina e inserito in un supporto elettrodo.
- Il titolare elettrodo viene collegato alla fase capo di un amplificatore intracellulare (IR-283, Cygnus Technology Inc) apposta sul braccio micropositioner.
- Una sezione molto piccola di retina (~ 1mm2) è esposta tagliando via l'interfaccia cornea con una lametta.
- Una goccia di soluzione di Ringer è posto sulla retina esposto contro l'essiccamento e la punta micropipetta è avanzato attraverso l'apertura nel tessuto retinico.
- Quando la punta entra nella soluzione, la modalità di iniezione di corrente dell'amplificatore intracellulare è impegnato e l'impedenza elettrodo viene misurato. Micropipette con impedenza di fuori del range di 20-70 MW vengono scartati. Quelli di questa gamma sono avanzati in passi micron e impalata in cellule facendo vibrare la punta della pipetta elettronica o meccanica.
- Tre tipi di cellule si possono incontrare negli occhi. Retinular cellule mostrano solo una risposta depolarizzante alla luce, le cellule mostrano eccentrico un treno di potenziali d'azione a cavallo su una risposta depolarizzante, e le cellule del pigmento non mostrano risposta di luce.
- I dati vengono raccolti con un programma personalizzato scritto in Labview. Il programma controlla stimoli luminosi tramite un processore video digitale (bit + +, Cambridge Research Systems). Gli stimoli vengono consegnati alle cellule impalato con un tubo in fibra ottica o video. Risposte tensione si osservano sul oscilloscopio e digitalizzati dal programma per computer.
Parte 6: Risultati Rappresentante
Un rappresentante ERG è mostrata in figura 2A. La forma d'onda rappresenta il riassunto elettricarisposta alla luce soprattutto delle cellule fotosensibile retinular, in quanto molto più numerosi delle cellule eccentrico e sono elettricamente accoppiate a loro. Non ci sono componenti delle forme d'onda multiple da diversi tipi di cellule della retina dei mammiferi come con l'ERG. Un feedback da un orologio circadiano nel cervello Limulus modula le proprietà fisiologiche delle cellule retiniche su base giornaliera, causando il corso ampiezza e l'ora di ERG a variare nel tempo (1). Come mostrato nella Figura 2B, ERG ampiezza è più alto durante la notte soggettiva dell'animale e più bassa durante il giorno soggettiva.
Una traccia di rappresentante di una risposta ottica singola fibra nervosa alla luce è mostrata in Figura 3. Cellule eccentrico tutti si comportano o meno lo stesso, mostrando un aumento transitorio del tasso di scarico picco seguito da un decadimento di un livello sostenuto. Il tasso di decadimento riflette l'azione combinata di adattamento alla luce e picco-dipendente di auto-inibizione sulle cellule eccentrico (2). Altri modelli di punta, come la luce-dipendenti della velocità, sono visti nel cervello Limulus, ma non l'occhio (3).
Tracce rappresentante della risposta di tensione di una cella cella di pigmento, cellula retinular, ed eccentrico alla luce sono mostrati in Figura 4. Solo gli ultimi due tipi di cellule della retina sono visive. Il corso ampiezza e l'ora della loro risposta dipende dalla qualità della registrazione e la posizione degli elettrodi all'interno della cellula. Di solito, l'elettrodo penetra le cellule del pigmento o cellule retinular a causa delle loro grandi dimensioni e numero. In quest'ultimo caso, una depolarizzazione transitoria che decade ad un livello sostenuto viene registrato. Il degrado è dovuto adattamento alla luce da parte delle cellule retinular (2). Se l'elettrodo entra in una cellula eccentrico, potenziali d'azione di grandi dimensioni sono registrati nel assone (40-70mV) e potenziali d'azione piccola guida su una forma d'onda depolarizzante (<25 mV) in prossimità del soma.
Figura 1. Diagrammi di camere utilizzate per la registrazione di elettroretinogramma (A) e la registrazione del nervo ottico (B). Bar A è uguale a 7 mm e 5 mm in B.
Figura 2. Traccia Esempio di ERG Limulus evocato da un impulso di 100ms LED 5V al buio (A) e il picco-picco fluttuazione in ampiezza ERG nel corso del tempo al buio costante (B). Tenebre è stato avviato al momento indicato dal triangolo bianco. La crescita in ERG ampiezza attraverso il tempo indicato dal triangolo nero è dovuta all'adattamento luce, che aumenta la sensibilità degli occhi nel buio. La variazione ciclica in ERG ampiezza è successivamente a causa di orologio interno circadiano dell'animale. Tempo punti in B sono ogni 5min.
Figura 3. Traccia Esempio di una risposta delle fibre del nervo ottico a luce flash su un solo recettore ommatidial. Forma d'onda al di sopra della traccia mostra tempismo stimolo. Cellule eccentrico, i cui assoni dare origine a fibre nervose, mostrano un modello simile di cottura in quanto alle condizioni di illuminazione dell'esperimento (5sec lampo nel buio più totale). Codifica della retina con punte è una Limulus proprietà ha in comune con i mammiferi, a differenza di altri invertebrati.
Figura 4 tracce Esempio di risposta di tensione alla luce dei tre tipi di cellule presenti negli occhi Limulus laterale:. Cellule del pigmento (A), la cella retinular (B), e la cella eccentrico (C). La prima cella è non-visiva. Gli ultimi due depolarizzare su un lampo di luce. La depolarizzazione è il più grande per le cellule retinular perché trasdurre la luce e inviare il segnale attraverso giunzioni gap alla cella eccentrico, con qualche perdita lungo la strada. Nella cella eccentrico, potenziali d'azione sparati da l'assone si vedono a cavallo sulla depolarizzazione causa di backpropagation picco nel soma. L'ampiezza dei potenziali d'azione è stato attenuato in figura per una migliore visualizzazione del potenziale depolarizzante. Il potenziale di riposo delle cellule è-50mV.
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Discussion
Abbiamo mostrato come eseguire registrazioni ERG, registrazioni nervo ottico, e le registrazioni intraretinica di granchi a ferro di cavallo in vivo. Le tecniche di registrazione ogni fornire spunti diversi in base neurali della visione, e tutti possono essere utilizzati per studiare la funzione retinica in vivo gli animali grazie alle grandi occhi del granchio e carapace duro. L'attività del nervo ottico può anche essere registrato dalle comportarsi liberamente gli animali in mare con la costruzione corretta degli elettrodi (4). Queste tecniche possono essere eseguite anche sugli occhi asportato con modifiche di dettaglio della configurazione. La rilevanza di tali esperimenti alla condizione naturale sarebbe limitato, in quanto le caratteristiche fisiologiche del cambiamento occhi del granchio quando viene rimosso dagli animali (5), ma il valore didattico sarebbe grande per un laboratorio didattico dato l'ampio uso di questi metodi in neuroscienze.
ERG registrazione, registrazione del nervo ottico, e la registrazione intraretinica sono stati presentati separatamente qui per motivi di chiarezza. In pratica, i metodi di registrazione multipla sono spesso combinati in un singolo esperimento di monitorare contemporaneamente i cambiamenti nell'attività neuronale e sensibilità visiva in uno o entrambi gli occhi laterali. La camera di piccole dimensioni che usiamo per la registrazione ERG è particolarmente vantaggiosa in questo senso rispetto ad altri tipi (1, 6). Inoltre, possiede un serbatoio di soluzione salina che viene sigillata da aria, eliminando i problemi di stabilità associati con stoppino elettrodi convenzionali che possono seccare nel tempo. La suite di esperimenti visione possibile con Limulus è ancora più grande di questo, perché le stesse procedure descritte per la registrazione del nervo può essere utilizzato per la stimolazione del nervo collegando l'elettrodo porta ad uno stimolatore elettrico invece di un amplificatore di segnale.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Werner Birgit per il suo aiuto con la produzione di questo articolo video. Questa ricerca è stata finanziata da un premio CARRIERA NSF.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| LED | Light source | Newark Inc | 33C1292 | |
| Suction electrode | Electrode | A-M Systems | 573000 | |
| XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier | Amplifier | FHC, Inc. | 40-40-8B | |
| Intracellular Recording | Amplifier | Cygnus | IR-283A | |
| APM | Neural Spike Discriminator | FHC, Inc. | APM | |
| Bits++ | Video Board | Cambridge Research Systems | Bits++ | |
| Piezopatch Manipulator | Micropositioner | World Precision Instruments, Inc. | PPM5000 | |
| Square Pulse Stimulator | Nerve Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Borosilicate Glass Capillary | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Horsesh– crab (Limulus polyphemus) | Animal | Marine Biological Laboratories | ||
| Micropipette Puller | Glass Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Zoom Stereoscope | Microscope | Jed Pella Inc. | SMZ-168 |
References
- Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
- Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
- Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
- Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
- Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
- Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).
