Summary
In diesem Video führen wir Elektroretinogramm Aufnahme, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme mit dem amerikanischen Pfeilschwanzkrebs
Abstract
Der amerikanische Pfeilschwanzkrebs Limulus Polyphemus ist eines der ältesten Lebewesen auf der Erde, und das Tier weiterhin eine unverzichtbare Rolle in der biomedizinischen Forschung spielen. Nicht nur, dass ihr Blut enthält spezielle Zellen, die Wissenschaftler nutzen, um bacteriotoxins in unserer Medikamente zu erkennen, aber ihre Augen auch ein neuronales Netz, das viele Einblicke in Ihre physiologische Prozesse, die in unser visuelles System, wie Licht Anpassung und laterale Inhibition zur Verfügung gestellt hat. Die Pfeilschwanzkrebses bleibt ein attraktives Modell für Vision Forschung, weil das Tier ist groß und robust für ein Wirbellosen, seine Netzhautneuronen groß und leicht zugänglich sind, ist seine visuelle System kompakt und umfassend untersucht, und seine visuelle Verhalten ist gut definiert. Darüber hinaus sind die Struktur und Funktion der Augen moduliert auf einer täglichen Basis von einem circadianen Uhr in der Tier-s Gehirn. Kurz gesagt, ist das visuelle System des Pfeilschwanzkrebse einfach genug, um noch verstanden werden komplex genug, um interessant sein.
In diesem Video stellen wir Ihnen drei elektrophysiologischen Paradigmen zur Untersuchung der neuronalen Grundlagen der Vision, die in vivo mit Limulus durchgeführt werden kann. Sie sind Elektroretinogramm Aufnahme, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme. Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen Maßnahme mit einer Fläche Elektrode der summierten elektrischen Reaktion aller Zellen im Auge, um einen Lichtblitz. Sie können verwendet werden, um die allgemeine Empfindlichkeit des Auges für verlängern Zeiträume zu überwachen. Sehnerv Aufnahmen messen spiking Aktivität einzelner Nervenfasern mit einer extrazellulären microsuction Elektrode. Sie können zur visuellen Botschaften vermittelt vom Auge an das Gehirn sowie circadiane Uhr Nachrichten zurück aus dem Gehirn zum Auge geführt zu studieren. Intraretinale Aufnahmen Maßnahme mit einer intrazellulären Mikroelektrode die Spannungsschwankungen durch Licht in einzelne Zellen des Auges ausgelöst. Sie können verwendet werden, um zelluläre Mechanismen der retinalen Verarbeitung aufzuklären.
Protocol
Teil 1: Experimentelle Vorbereitung
Experimentelle Verfahren auf Pfeilschwanzkrebse durchgeführt wurden vom Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Boston University genehmigt worden. Die Tiere sind von der Marine Biological Labs (Woods Hole, MA) oder ein anderer Verkäufer erworben und befindet sich in einem belüfteten Salzwassertank in einem Raum ausgesetzt zu einem geregelten Hell-Dunkel-Zyklus. Die Beleuchtung Regime ist zum Mitführen der Krabbe circadianen Uhr und Radfahren das Auge täglich zwischen seiner Tages-und Nachtzeit Staaten wichtig. Unmittelbar vor Beginn einer invasiven Verfahren wird das Tier in einem Eiskübel für 10-15 Minuten gekühlt, bis seine Bewegung verlangsamt und dann auf einer hölzernen Plattform gesichert mit zwei Schrauben aus Edelstahl in der Prosoma eingesetzt und zwei in den Hinterleib. Die Plattform ist unter mit Granit gewichtet, so dass es im Wasser versinkt. Nach Anschluss Experimenten wird das Tier durch Eintauchen in Eis Gülle wieder und Rückenmarkzerstörung des Gehirns, die oberhalb der Mündung liegt, mit einem Skalpell eingeschläfert.
Teil 2: Lösungen
Limulus Ringer-Lösung ist von 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50 &mgr; TES, 50 &mgr; HEPES und 10 ml / L Pen-Strep-Mix (Penicillin-Streptomycin, 10000 Einheiten / ml) zusammen .
Teil 3: Elektroretinogramm Recording
Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt eine Schraubenzieher, Vaseline, Ringer-Lösung, einer Transferpipette, eine grüne LED, eine Aufnahme Kammer, Schrauben aus Edelstahl und einem Wattestäbchen.
- Eine handgefertigte Kammer wird die ERG (Abbildung 1A) aufnehmen. Die Kammer Körper ist entworfen, um eine Kochsalzlösung Reservoir in Kontakt mit dem Auge zu halten. Der Deckel enthält eine Silberchlorid Draht zur Kopplung der leitende Lösung mit einem Verstärker und einem kleinen Loch so bemessen, dass eine LED aufnehmen. Eine ultrahelle mit Peak Emission um 520nm LED am besten funktioniert.
- Um zu beginnen, ist die Unterseite der Kammer mit Vaseline beschichtet und gesichert über das Auge mit zwei Schrauben.
- Die Kammer wird dann mit Kochsalzlösung gefüllt und verschlossen mit dem Deckel.
- Nach Kammer Befestigung der Krebs ist in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist.
- Die LED-Kabel wird in die Kammer Deckel eingefügt.
- Das Signal führen ist, die Chlorid-Draht abgeschnitten, und der Verweis führt zu einer der implantierten Schrauben abgeschnitten.
- Beide Leitungen sind auf den Kopf Stufe eines hochohmigen Differenzverstärker (X-cell 3x4, FHC Inc.) zur Signalverstärkung und der Verstärker-Filter gesetzt, um Frequenzen unterhalb 10Hz pass verbunden.
- Der Verstärkerausgang ist an ein Oszilloskop für die Anzeige und einer Messkarte für Computer-Analyse und Speicherung zugeführt.
- Nach der Einrichtung des Käfigs Tür geschlossen ist, um Platz Licht vom Erreichen des Tieres zu blockieren.
- Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabView geschrieben gesammelt. Das Programm blinkt die LED, Aufzeichnungen der evozierten ERG-Signal, und misst die peak-to-Peak-Ansprechen Amplitude. Die Wahl des Flash-Paradigma ist abhängig von der experimentellen Ziel. Zum Beispiel angewendet einer kurzen (100ms) Puls von 5V alle 10 Minuten, um die LED verhindert Wirkung von Licht Anpassung bei der Überwachung von circadianen Veränderungen in Augenempfindlichkeit.
Teil 4: Sehnerv Aufnahme
Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt eine Schraubendreher, Faden, ein Trepan, Ringer-Lösung, Rongeure, Vannas Schere, eine Aufnahme Kammer, gebogene Pinzette, feinen Nadel-Sonden, ein stumpfes Skalpell, chirurgische Scheren, und eine Saug-Elektrode.
- Eine handgefertigte Kammer wird benutzt, um Sehnerv Reaktionen (Abbildung 1B) aufnehmen. Das Innere der Kammer ist 2cm Durchmesser offene gut, dass eine dünne halbrunden Schlitzöffnung in der unteren Wand, um den Nerv unterzubringen und zu isolieren, sie aus den umliegenden Gewebe.
- Bevor Kammer Befestigung einer 16-Gauge-Nadel wird zwischen dem Scharnier Muskeln in das Herz eingeführt und ~ 20ml Blut aus dem Tier abgelassen. Blutleere ist nicht notwendig, sondern macht Sehnerv Dissektion leichter.
- Die Lage des Sehnervs ist, indem sie auf den Panzer einer leicht gebogenen Linie zwischen den seitlichen und mittleren Augen geschätzt.
- Ein kreisrundes Loch wird dann in den Panzer mit einem Trepan geschnitten. Das Loch ist den gleichen Durchmesser wie die Kammer gut. Die Mitte des Loches ist 2-3 cm vor dem lateralen Auge und etwas dorsal der Linie, so dass der Nerv entlang der ventralen Teil der gut verläuft.
- Das Bindegewebe wird gelöscht, bis der Nerv vollständig sichtbar und frei von umgebenden und darunter liegende Gewebe.
- Ein Strang der Thread um den Nerv geschlungen und zog in die Kammer durch den Schlitz an der Unterseite. Durch diese gleiche Öffnung der Nerv vorsichtig in die Kammer durch Ziehen an der Schnur geführt. Zur gleichen Zeit der Kammer ist gut in das Loch gesteckt. Die Kammer wird dann auf dem Panzer angebrachtmit Schrauben und der Brunnen ist mit Ringer-Lösung gefüllt.
- Nach Kammer Befestigung des Tieres wird in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist.
- Der Brunnen ist unter einem Stereoskop (SMZ-168, Jed Pella Inc.) und Baumwolle ist rund um die Öffnung im Boden gepolstert, um das Auslaufen von Blut in und Kochsalzlösung aus der Kammer zu verhindern visualisiert.
- Residual Bindegewebe um die Nerven mit einer feinen Schere und Pinzette entfernt und die Kammer wird mit frischem Ringer-Lösung aufgefüllt.
- Ein nick ist in das Blutgefäß, dass der Nerv kapselt und durch diese Öffnung der Nerv sorgfältig entlang seiner Länge mit einer feinen Schere, Pinzette und Nadel-Sonden desheathed gemacht.
- Ein winziges Faserbündel vom Nerv mit der Sonde und Schnitt am Ende am weitesten vom Auge für afferente Faser Aufnahme und am Ende am nächsten an das Auge für efferente Faser Aufnahme getrennt. In dem Video das Ende für afferente Faser-Aufnahmen geschnitten wird.
- Ein microsuction Elektrode (AM Systems Inc) mit Ringer-Lösung gefüllt ist für Sehnerv Aufnahme verwendet. Die Elektrodenspitze ist es, die Nerven-Bündel von Feuerpolitur Ende einer 1mm Durchmesser Borosilikatglas Kapillare ausgestattet.
- Die Elektrodenspitze wird in die Kammer auch mit einem manuellen Manipulator (WPI Inc) gesenkt, und der Schnitt Faserbündel in die Spitze gesaugt. Saug wird durch eine Gilmont Spritze verbunden mit der Elektrode über Schläuche zur Verfügung gestellt.
- Ein BNC-Anschluss bietet die Signalleitung und eine Silberchlorid Draht um die Elektrode herum gewickelt, um Lärm zu reduzieren bietet die Referenz führen. Die beiden Leitungen sind an den Kopf der Bühne eines Differenzverstärkers zur Signalverstärkung und Rauschfilter (X-cell 3x4, FHC Inc.) verbunden. Der Verstärkerausgang ist an ein Oszilloskop für die Anzeige und eine Messkarte für Computer-Analyse und Speicherung an.
- Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabView geschrieben gesammelt. Das Programm steuert Lichtreize über einen digitalen Video-Prozessor (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) und Schnittstellen mit einer digitalen spike Diskriminator (APM, FHC Inc.), die Spike-Datensätze. Das Licht kann auf einzelne Zellen in das Auge über ein Glasfaserkabel Lichtleiter oder das gesamte Auge geliefert über einen Computer-gesteuerten Video-Display.
Teil 5: intraretinale Aufnahme
Die Werkzeuge für diese Prozedur benötigt gehören ein Schraubenzieher, ein L-förmiges Lucite-Plattform mit Gewindebohrungen, einer Mikroelektrode Halter mit einer Glaspipette, Schrauben aus Edelstahl, eine Pinzette und eine feine Skalpell.
- Eine handgefertigte Lucite-Platte mit voreingestellten Schraubenlöcher wird verwendet, um intrazelluläre Reaktionen aufzuzeichnen. Die Löcher sind für die Montage eines motorisierten Mikromanipulator (PPM5000, WPI Inc) angeordnet. Die Platte wird das Tier mit zwei Schrauben an der Seite und einer auf der Oberseite angebracht.
- Nach Plattenbefestigung das Tier ist in einem lichtdichten Käfig in einem Tank mit Meerwasser über die Kiemen gefüllt ist.
- Die micropositioner ist in der Platte verschraubt, mit seinem beweglichen Arm über dem Auge ausgerichtet.
- Eine Charge von Glasmikropipetten sind aus 1-mm OD Borosilikatglas gezogen und die Spitzen sind durch Kapillarwirkung, indem Sie die Mikropipetten in einem kleinen Fläschchen mit 3M KCl-Lösung aufgefüllt.
- Der Rest der Pipetten werden dann manuell mit der Salzlösung gefüllt und in einen Elektrodenhalter.
- Der Elektrodenhalter ist auf den Kopf Stufe eines intrazellulären Verstärker (IR-283, Cygnus Technology Inc) angebracht, die micropositioner Arm verbunden.
- Ein winziger Teil der Netzhaut (~ 1mm2) wird durch Wegschneiden der Hornhaut-Schnittstelle mit einer Rasierklinge ausgesetzt.
- Ein Tropfen Ringer-Lösung basiert auf der Netzhaut platziert ausgesetzt Trocknung zu verhindern und die Mikropipette Spitze ist durch die Öffnung in Netzhautgewebe fortgeschritten.
- Wenn die Spitze der Lösung eintritt, wird die Stromeinspeisung Modus des intrazellulären Verstärker engagiert und Elektrodenimpedanz gemessen. Mikropipetten mit einer Impedanz außerhalb des Bereichs von 20-70 MW werden verworfen. Wer in diesem Bereich sind in Mikron Schritte fortschrittliche und spießte in Zellen durch Vibrieren der Pipettenspitze elektronisch oder mechanisch.
- Drei Arten von Zellen im Auge auftreten. Retinular Zellen zeigen nur eine depolarisierende Reaktion auf Licht, zeigen exzentrischen Zellen ein Zug der Aktionspotentiale reitet auf einem depolarisierenden Antwort, und Pigmentzellen zeigen keine leichte Reaktion.
- Die Daten werden mit einem benutzerdefinierten Programm in LabVIEW geschrieben gesammelt. Das Programm steuert Lichtreize über einen digitalen Video-Prozessor (Bits + +, Cambridge Research Systems). Die Reize werden aufgespießt Zellen mit einem Glasfaser-Rohr-oder Video-Display ausgeliefert. Spannung Antworten sind auf dem Oszilloskop beobachtet und digitalisiert das Programm auf den Computer.
Teil 6: Repräsentative Ergebnisse
Ein Vertreter ERG ist in Abbildung 2a dargestellt. Die Wellenform stellt die summierten elektrischenReaktion auf Licht in erster Linie die photorezeptorischen retinular Zellen sind, wie sie wesentlich mehr Männer als die exzentrische Zellen und diesen elektrisch gekoppelt. Es gibt nicht mehrere Wellenform Komponenten aus verschiedenen retinalen Zelltypen wie bei den Säugetieren ERG. Circadian Feedback von einer Uhr in der Limulus Gehirn moduliert die physiologischen Eigenschaften der Zellen der Netzhaut auf einer täglichen Basis, wodurch die Amplitude und Zeitverlauf der ERG im Laufe der Zeit (1) variieren. Wie in Abbildung 2B gezeigt, ist ERG Amplitude am höchsten während des Tieres subjektiven Nacht und am niedrigsten bei der subjektiven Tag.
Ein Vertreter Spur von einer einzigen optischen Nervenfasern Reaktion auf Licht ist in Abbildung 3 dargestellt. Exzentrische alle Zellen verhalten sich in etwa die gleichen, die eine vorübergehende Erhöhung der Spike-Fördermenge durch einen Zerfall zu einer nachhaltigen Niveau folgte. Die Rate Zerfall spiegelt die kombinierte Wirkung von Licht Anpassung und Spike-abhängige Selbst-Hemmung auf exzentrischen Zellen (2). Andere Spike-Muster, wie Licht-abhängige Abnahme der Geschwindigkeit, in der Limulus Gehirn gesehen, aber nicht das Auge (3).
Vertreter Spuren der Spannung Reaktion eines Pigments Zelle, retinular Zelle und exzentrischen Zelle Licht sind in Abbildung 4 dargestellt. Nur die beiden letztgenannten retinalen Zelltypen sind visuell. Die Amplitude und Zeitverlauf der Reaktion hängt von der Qualität der Aufnahme und die Lage der Elektrode in der Zelle. Normalerweise dringt die Elektrode Pigmentzellen oder retinular Zellen aufgrund ihrer großen Anzahl und Größe. Wenn das letztere, eine vorübergehende Depolarisation, die zu einem nachhaltigen Niveau abfällt wird aufgezeichnet. Der Zerfall wird durch Helladaptation durch retinular Zellen (2). Wenn die Elektrode tritt eine exzentrische Zelle, sind groß Aktionspotentiale im Axon (40-70mV) und kleine Aktionspotentiale reitet auf einem depolarisierenden Wellenform (<25mV) in der Nähe des Soma aufgezeichnet.
Abbildung 1. Schematische Darstellungen der Kammern für Elektroretinogramm Aufnahme (A) und Sehnerv-Aufnahme (B) verwendet. Bar gleich 7mm in A und 5mm in B.
Abbildung 2. Beispiel Spur eines Limulus ERG durch ein 100ms evozierte LED-Puls von 5V im Dunkeln (A) und der Peak-to-peak Fluktuation in ERG Amplitude über die Zeit in konstanter Dunkelheit (B). Dunkel war die damals von den weißen Dreieck angezeigt eingeleitet. Das Wachstum in ERG Amplitude über die Zeit von der schwarzen Dreieck gekennzeichnet ist durch geringes Anpassung, die Augenempfindlichkeit steigt in der Dunkelheit. Die zyklischen Schwankungen in ERG Amplitude danach ist aufgrund des Tieres internen zirkadianen Uhr. Zeitpunkten in B sind alle 5min.
Abbildung 3. Beispiel Spur eines Sehnervs Faser Antwort auf eine einzige ommatidial Rezeptor blitzte Licht. Waveform oberhalb der Kurve zeigt Reiz Timing. Exzentrische Zellen, deren Axone führen zu Nervenfasern, die alle zeigen ein ähnliches Muster von Feuern, wie dies unter den Lichtverhältnissen des Experiments (5sec Blitz in völliger Dunkelheit). Retinal-Codierung mit Spikes ist eine Eigenschaft Limulus hat gemeinsam mit Säugetieren, im Gegensatz zu anderen Wirbellosen.
Abbildung 4 Beispiel Spuren von der Spannung als Reaktion auf die drei Zelltypen im Limulus lateral Auge Licht:. Pigment-Zelle (A), retinular Zelle (B), und exzentrische Zelle (C). Die erste Zelle ist nicht-visuelle. Die beiden letzteren auf einen Lichtblitz depolarisieren. Die Depolarisation ist das größte für retinular Zellen, weil sie das Licht transduzieren und senden das Signal über Gap Junctions, um den exzentrischen Zelle, mit einem gewissen Verlust auf dem Weg. In der exzentrischen Zelle werden Aktionspotentiale durch das Axon abgefeuert gesehen Reiten auf die Depolarisation durch spike Backpropagation in den Soma. Die Amplitude der Aktionspotentiale wurde in der Abbildung gedämpft für eine bessere Anzeige des depolarisierenden Potential. Das Ruhepotential der Zellen-50mV.
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Discussion
Wir haben gezeigt, wie man ERG-Aufnahmen, Sehnerv-Aufnahmen und intraretinale Aufnahmen auf Pfeilschwanzkrebse in vivo durchzuführen. Die Aufnahme-Techniken bieten jeweils unterschiedliche Einblicke in die neuronalen Grundlagen des Sehens, und sie können alle verwendet werden, um die Funktion der Retina in lebenden Tieren durch die Krabbe große Augen und harten Panzer zu studieren. Sehnerv Aktivität kann auch von frei lebenden Tier in den Ozean mit der richtigen Konstruktion der Elektroden (4) aufgenommen werden. Diese Techniken können auch auf herausgeschnitten Augen mit geringfügigen Änderung der Konfiguration durchgeführt werden. Die Bedeutung solcher Experimente zu den natürlichen Zustand wäre begrenzt, da die physiologischen Eigenschaften der Krabbe Auge zu ändern, wenn von dem Tier (5) entfernt, aber die Lehr-Wert wäre ideal für einen Lehr-Labor angesichts der weit verbreiteten Anwendung dieser Methoden in Neurowissenschaften.
ERG Aufzeichnung, Sehnerv Aufnahme und intra-Aufnahme wurden separat hier für Klarheit halber vorgestellt. In der Praxis werden mehrere Aufnahmen Methoden oft in einem einzigen Experiment kombiniert, um gleichzeitig überwachen Veränderungen der neuronalen Aktivität und visuelle Empfindlichkeit in einem oder beiden seitlichen Augen. Die kleine Kammer, die wir für ERG Aufnahme ist besonders vorteilhaft in dieser Hinsicht im Vergleich zu anderen Designs (1, 6). Darüber hinaus hält sie ein Reservoir von Kochsalzlösung, die aus der Luft verschlossen ist, wodurch die Stabilität, die mit herkömmlichen Docht Elektroden, die austrocknen können im Laufe der Zeit verbunden. Die Suite der mögliche Vision Experimente mit Limulus ist sogar größer als das, weil das gleiche Verfahren für die Nerven der Aufnahme beschrieben werden zur Nervenstimulation durch die Verbindung der Elektrode führt zu einem elektrischen Stimulator statt einen Signalverstärker verwendet werden.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Birgit Werner für ihre Hilfe bestätigen Sie mit der Erstellung dieses Video Artikel. Diese Arbeit wurde durch einen NSF Career Award finanziert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| LED | Light source | Newark Inc | 33C1292 | |
| Suction electrode | Electrode | A-M Systems | 573000 | |
| XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier | Amplifier | FHC, Inc. | 40-40-8B | |
| Intracellular Recording | Amplifier | Cygnus | IR-283A | |
| APM | Neural Spike Discriminator | FHC, Inc. | APM | |
| Bits++ | Video Board | Cambridge Research Systems | Bits++ | |
| Piezopatch Manipulator | Micropositioner | World Precision Instruments, Inc. | PPM5000 | |
| Square Pulse Stimulator | Nerve Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| P-97 | Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Borosilicate Glass Capillary | Electrode glass | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Horsesh– crab (Limulus polyphemus) | Animal | Marine Biological Laboratories | ||
| Micropipette Puller | Glass Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Zoom Stereoscope | Microscope | Jed Pella Inc. | SMZ-168 |
References
- Barlow, R. B. Jr Circadian rhythms in the Limulus visual system. J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).
- Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. Cell based model of the Limulus lateral eye. J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).
- Snodderly, D. M. Jr Processing of visual inputs by the brain of Limulus. J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).
- Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. Deciphering a neural code for vision. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).
- Barlow, R. B., Kaplan, E. Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye. Science. 174, 1027-1029 (1971).
- Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye. J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).
