Summary
我々は、金の微小電極とシリコン基板上にポリ（エチレングリコール）自己組織化単分子膜を（PEG - SAM）を形成するための手順を示します。 PEG - SAMは、単一工程で形成し、シリコンと金の表面に生物付着を防止しています。電気泳動は、ナノスケールにパターニング生体分子のためにダウンして使用されます。
Abstract
我々は、金の微小電極とシリコン基板上にポリ（エチレングリコール）（PEG）トリメトキシシラン自己組織化単分子膜（SAM）を形成するための手順を示します。 PEG - SAMは、単一のアセンブリ工程で形成し、シリコンと金の表面に生物付着を防止しています。 SAMは、標準、ポジ型のリソグラフィでパターン化されたコートの微小電極に使用されます。例として、微小管を使用して、我々は、可逆的な方法でSAM被覆電極に電気泳動を誘導するDC電圧を印加してください。フローチャンバーは、イメージングのために電気泳動と微小管のパターニングを使用されています
Protocol
試薬の調製
PIPESバッファー（KOHでpH6.8に調整した80mMのPIPES、1mMのMgCl 2を 、1mMのEGTAを、）準備する。 -70分注し、店舗のグルコースオキシダーゼ、カタラーゼとグルコース-20 ° Cとタキソール℃の既存のプロトコルに応じて。-70 1,2分注しストアのチューブリン° C供給者が含まれている手順に従って。
リソグラフィーを用いたパターンのAu微小電極
- スクライブまたはウェハのカッターを使用して1 Cm'と1.5cmの基板にシリコンウエハーをカット。それらをカバーし、5分間超音波処理するのに十分なアセトンをビーカーに配置することにより、基板をクリーニング。基板を乾燥させることなく、新鮮なアセトンでそれらを洗い流した後、直ちにイソプロパノールと乾燥を使用して窒素ですすいでください。
- 希望の機能の大きさに応じて、標準、ポジ型のフォトリソグラフィーや電子線リソグラフィーを用いてクリーンな基板上にAu電極を作製。3パターンの形状を設計するとき、によってカバレッジを確保するために、100ミクロン以下の各電極パターンの直径を保つPEG SAM（次のセクションで説明）。電極（図1）でパッドを接続して1mmの線のパターンから500 mmまでの300を位置付け接触パッドを（〜300 mm 2）を含めます。フローチャンバーを組み立てるためのパターンの周囲にスペースを可能にするために基板の中央付近にリソグラフィパターンを置きます。
図1サンプルの形状。してくださいここをクリックして図1の拡大バージョンを参照すること。 - レジスト層のパターンの開発の後、ピンセット（図1）を使用して、基板のエッジに接触パッドからレジストのラインに傷を付けない。金属蒸着時には、スクラッチは、電極と基板の端との間の電気的接触が可能になります。好ましくは二つの情報源と成膜チャンバは、、金属層を堆積させるために使用されます。電極は、真空を破ることなく、Auの6nmのに続いてCrのは2nm（接着用）の堆積によって形成される。チャンバー内部に搭載した水晶振動子マイクロバランス法は、蒸着時のフィルムの厚さを測定するために使用することができます。
SAMを準備
- 予熱および75換気の良い場所で℃のオーブン250mLのガラスビーカーにトルエン20mLを添加することによりシリル化ソリューションを準備する。その後、プラスチックピペットを用いてトルエンに1 mLのPEG -シラン（すなわち5％v / v）を追加。ピペッティング5〜10倍にしてから30秒間ピペットで撹拌することにより、PEG -シランよくで混ぜる。
- 彼らは完全にPEG -シラントルエン溶液中に浸漬され、均等にビーカーの底部全体に等間隔ていることを確認しながら、上を向いてパターニングされた側とビーカー内でパターン化されたサンプルを置きます。オーブンでビーカーを置き、75で18〜21時間を焼く℃にSAMが形成されている間、対向の準備（下記参照）と、残りの手順に必要な追加のコンポーネントを組み立てます。
- オーブンで18〜21時間後、トルエンは粘性PEG -シラン残渣にパターン化されたサンプルを残して蒸発してください。ビーカーにトルエン20mlを追加して1-2分のサンプルを浸す。ビーカーからサンプルを削除してから、トルエン、イソプロパノールでリンスし、窒素を用いて最終的に乾燥した。この時点で、サンプルがきれいになっているはずですし、SAMの層は、肉眼では見えないはずです。 SAMのは、涼しい乾燥した条件（25℃、適度な湿度）下で保存した場合、最大2日まで使用可能なこの方法を準備した。表面の曇りや凹凸のある色のついた残のコーティングで失敗したSAMの形成の結果。
対向を作り上げる
微小電極の堆積のために使用される同一成膜室のセットアップでは、22 × 50mmの1番か0番のガラスカバースリップ上のAuの4nmのに続いてCrの1nmを、堆積することによって対向電極を作る。対向はライトグレーやピンクの色合いとほぼ透明にする必要があります。それをきれいに保つためにシャーレにコーティングされた側を対向して保管してください。
MTSにチューブリンの重合
- 未標識チューブリンとローダミンのチューブリンを解凍し、すぐに明るいMTを取得するために非標識する標識された1:2の比率で組み合わせる。数回上下にピペッティングして混ぜる。 37加熱した水浴中で20-40分のためのチューブリンを重合℃にMTの長さが長く、重合時間のために大きくなります。チューブリンが重合している間、PIPES緩衝液を含むマイクロ遠心チューブに20 mMにタキソールを追加することによって、PIPES -タキソールバッファを準備。上下に数回ピペッティングし、ボルテックスでよくタキソールを混合し、37℃で加熱した浴中にチューブを置きます℃に重合後、暖かいPIPES -タキソールバッファとシールドは1 / 100でMTを薄める軽いから。このようにして調製したMTSは、時間とさらに希釈することによって減らすことができるバンドルを、上に細長いなります。
- 30 mLの冷PIPES緩衝（0-4℃）、2 -メルカプトエタノール50％、カタラーゼ5mLのグルコースオキシダーゼ、5mLの、そして5mLのグルコースの5 mLを組み合わせることにより10倍の酸素掃気混合物（OS）を用意する。グルコース最後に追加する必要があります。各コンポーネントを追加した後に3-5回ピペッティングにより混和する。氷の上でOSの混合物を置き、それは約2時間のために効果的なままになります。
- 準備MTSは1XのOSが混在してMTの重合が成功したことと、MTSはイメージングすることにより、蛍光励起の数分で安定していることを確認します。イメージングのためにこのようにして調製したMTSは、ローダミンの蛍光に適した励起/発光フィルターの組み合わせを使用してください。さらに1 × OSのミックスでPIPES緩衝とイメージングを使用して1 / 10 1 / 100にして、MTSを希釈することにより、イメージング、個々のフィラメントに最適な希釈率を決定する。
- 両面テープの2つが離れて2〜3ミリメートルを置くと大（22 × 50 mm）と小型（22 × 22ミリ）のガラスカバースリップを挟むことにより、フローチャンバーを準備します。テープは簡単にガラススライド上に置き、カミソリの刃で切断して短冊状にカットされます。マイクロピペットを用いてフローセルにMTのいくつかのマイクロリットルを導入する。高倍率のイメージングのために、長い作動距離の目標は、イメージングフローチャンバーの上面のために必要となる場合があります。フローチャンバーの上面にカバースリップ/試料表面からの距離は、テープの厚さによって決定されると60〜100ミリメートルでなければなりません。
電気泳動を用いてパターンのMT
- 電極は、テープ（図2）に垂直に接続するパスとストリップの間にあるような模様の、SAM被覆したサンプル全体に両面テープの二つの薄いストリップを配置することにより、電気泳動槽を準備します。このようなテープに触れる金属側に両面テープで対向電極を配置することを約3mm（図2）によるサンプルのオーバーハング対向のエッジ。被覆銅マグネットワイヤーのいくつかの15cmの長さをカットし、両端から絶縁体の1cmをはがします。 （これはマルチメータで確認できます）対向電極との電気的接触を避けるために注意しながら銀塗装の小さなドロップを使用して、基板の露出のAuのエリアにワイヤを取り付けます。銀塗料を使用して対向する2番目のワイヤを取り付けます。銀の塗料で接続されたワイヤは、さらにテープで試料に固定することができます。
倒立型蛍光顕微鏡は図2。フローセルアセンブリ。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。 - 1 ×最終濃度でOSと組み合わせてPIPES緩衝液を用いて所望の希釈でMTを導入する。 20倍の倍率で画像や電圧を印加する前に、シリコンウエハ上にパターンを見つけます。に応じて、フローチャンバーは、フローチャンバーの平面内の流体の流れとMTの移行を防止するために磨く爪を使ってシールすることができる。
- 最大1 Vの電圧を印加し、MTの移行を観察。 MTの可逆的トラップが望まれる場合、低い電圧（0.5 V程度まで）を用いてもよいですが、これは横方向のドリフトを防ぐために、フローチャンバーを密閉する必要があります。マニキュアは、フローチャンバーの開口端をシールに適しています。約0.7 V以上の電圧では、いくつかMTの密着性は、それは弱いだろうけど、パターンに見られるかもしれない。約0.9 V以上の電圧で、MTの移行は速くなり、密着性が強くなります。約1.2 Vの上に誘導電気分解（ガスの気泡形成）のため、また、微小電極を破壊する可能性が大幅に増加します。移行は、顕微鏡の焦点の垂直面を調整することによって追跡することができます。正しく実施した場合、MTSは電極表面でローカライズされます。
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Discussion
MTの移行を容易にするため、その明るさと低バックグラウンドの蛍光を蛍光顕微鏡を用いて可視化されています。それが唯一の生体分子は緩衝液の適切な調整により、正味の電荷を運ぶために誘導されている必要がありますように、メソッドは、一般的に生体分子パターニングに適用可能である。このようなキャピラリー電気泳動に使用されるシリカの壁などの無帯電した表面が存在するため、電気浸透は、この設定で回避されます。
この方法のいくつかの変更が可能です。開放端からの蒸発は、バルク流体の流れと望ましくないMTの移行を発生するため、フローチャンバーの両端をシールする可逆性を観察することが重要です。リソグラフィパターニングの前にシリコンウェーハの酸化が同時に使用される独立した電位を持つ複数の電極を可能にする、基板を介して導通を防止します。
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Acknowledgments
我々は、SAMの形成に有用な議論をメリッサGrunlanを認めます。この研究は、ロバートA.ウェルチ財団（A - 1585）で部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | 6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1 |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| Acetone | EMD Millipore | AX0120-8 | ACS grade |
| Catalase | Calbiochem | 219001-5MU | |
| Chlorobenzene | EMD Millipore | MK441908 | ACS grade |
| Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Calbiochem | 324626 | |
| Glucose | EMD Millipore | DX0145-1 | |
| Glucose oxidase | MP Biomedicals | 100330 | |
| Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP) | Jena Biosciences, GmbH | NU-405s | |
| Guanosine-5’-triphosphate | Sigma-Aldrich | G8752 | |
| Isopropanol | EMD Millipore | PX1835-5 | ACS grade |
| Methyl isobutyl ketone (MIBK) | Fisher Scientific | AC12739-0010 | |
| Paclitaxel (taxol) | Calbiochem | 580555 | |
| Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Sigma-Aldrich | P1851 | |
| Polymethylmethacrylate (PMMA) | Brewer Science, Inc. | 950K | molecular weight 950K |
| Rhodamine tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T331M | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
| Toluene | EMD Millipore | TX0735-5 | ACS grade |
| Tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T238 | from bovine brain 99% pure, lyophilized |
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies. |
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References
- Tubulin Polymerization with GTP/GMPCPP/Taxol [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/poly.html (2009).
- Flow Cell Assays with Microtubules: Motility/Dynamics [Internet]. , Harvard University. Cambridge, Ma. Available from: http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/flowcell.html (2009).
- Handbook of Microlithography, Micromachining, and Microfabrication: Microlithography. Rai-Choudhury, P. , SPIE Press. Bellingham, WA. (1997).
