Antifouling עצמית התאספו monolayers על Microelectrodes עבור ביומולקולות דפוסים

Summary

אנו מציגים הליך לגיבוש פולי (אתילן גליקול) עצמית התאספו monolayer (PEG-SAM) על מצע סיליקון עם microelectrodes זהב. PEG-SAM נוצר בשלב אחד ומונע Biofouling על משטחי סיליקון וזהב. אלקטרופורזה לאחר מכן נעשה שימוש עבור ביומולקולות דפוסים עד הננומטרי.

Abstract

אנו מציגים הליך לגיבוש פולי (אתילן גליקול) (PEG) monolayer trimethoxysilane עצמית התאספו (SAM) על מצע סיליקון עם microelectrodes זהב. PEG-SAM נוצר בשלב הייצור בודד ומונע Biofouling על משטחי סיליקון וזהב. SAM משמש microelectrodes מעיל עם הדפס ליתוגרפיה רגיל בטון חיובי,. שימוש microtubule כדוגמה, אנחנו מיישמים מתח DC לגרום הגירה electrophoretic אל האלקטרודה SAM מצופה באופן הפיך. תא זרימה משמש הדמיה ההגירה electrophoretic ו דפוסים microtubule

Protocol

הכנה של ריאגנטים

הכן צינורות חיץ (80 צינורות מ"מ, 1mm MgCl _2, 1mm EGTA, מותאם pH 6.8 עם KOH). Aliquot וגלוקוז אוקסידאז חנות, Catalase וגלוקוז ב -70 ° C ו טקסול ב -20 מעלות צלזיוס על פי פרוטוקולים קיימים. Aliquot ^1,2 ו טובולין חנות ב -70 ° C בהתאם להוראות כלל על ידי הספק.

תבנית Au microelectrodes באמצעות ליתוגרפיה

1. חותכים פרוסות סיליקון לתוך 1.5 1 'סמ מצעים ס"מ בעזרת סופר או חותך פרוסות. נקו את מצעים ידי הצבתם בכוס עם אצטון מספיק כדי לכסות אותם sonicate במשך 5 דקות. בלי המאפשר מצעים להתייבש, לשטוף אותם אצטון טרי, ומיד לשטוף בחנקן באמצעות isopropanol ויבש.
2. לפברק microelectrodes Au על מצעים נקיים באמצעות תקן, בטון חיובי photolithography או קרן אלקטרונים ליתוגרפיה, בהתאם לגודל של התכונות הרצויות. ³ בעת תכנון הגיאומטריה דפוס, לשמור על תבנית בקוטר של כל אלקטרודה להלן 100 מיקרון, כדי להבטיח כיסוי של PEG SAM (המתואר בסעיף הבא). כלול כריות מגע (~ 300 מ"מ ²⁾ ממוקם 300 מ"מ 500 מהתבנית עם קו 1 מ"מ המחבר את כרית עם האלקטרודה (איור 1). מניחים את תבניות ליתוגרפיות קרוב לאמצע של המצע, כדי לאפשר מרחב סביב התבנית להרכבת הקאמרית הזרימה.
   
   באיור 1. הגיאומטריה לדוגמה. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1.
3. לאחר התפתחות דפוס בשכבה להתנגד, לגרד קו להתנגד מהפנקס קשר לשפת המצע באמצעות פינצטה (איור 1). לאחר בתצהיר מתכת, שריטה יאפשר מגע חשמלי בין האלקטרודה לבין קצה המצע. תא בתצהיר, רצוי עם שני מקורות, משמש להפקיד את שכבת מתכת. האלקטרודות נוצרות על ידי בתצהיר של 2 ננומטר של Cr (עבור הדבקה) ואחריו 6 ננומטר של Au, בלי לשבור ואקום. Microbalance קריסטל קוורץ מצויד בתוך החדר יכול לשמש כדי למדוד את עובי של סרטים במהלך בתצהיר.

הכן את SAM

1. מחממים בתנור באזור מאוורר היטב על 75 ° C. הכן את הפתרון silanization ידי הוספת 20 מ"ל של טולואן אל מבחנה 250 מ"ל זכוכית. לאחר מכן להוסיף 1 מ"ל PEG-silane (כלומר 5% v / v) ל טולואן בעזרת פיפטה פלסטיק. מערבבים את PEG-silane היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה 5 עד 10 פעמים ואז לערבב עם פיפטה למשך 30 שניות.
2. מניחים את דגימות בדוגמת בכוס עם הצד בדוגמת כלפי מעלה, כדי לוודא כי הם שקועים לחלוטין פתרון PEG-silane טולואן מחולקת באופן שווה על פני החלק התחתון של הגביע. מניחים את כוס לתנור ואופים 18-21 שעות 75 ° C. בעוד SAM הוא להרכיב, להכין את counterelectrode (ראה להלן) ולהרכיב כל רכיבים נוספים הנדרשים על יתר השלבים.
3. לאחר 18-21 שעות בתנור, טולואן צריך להתאדות עוזב את דגימות בדוגמת משקע ב-PEG silane צמיג. הוסף 20 מ"ל של טולואן על כוס ולספוג את הדגימות עבור 1-2 דקות. הסר את דגימות מן הקנקן ולשטוף עם טולואן, אז isopropanol, ויבש סוף סוף עם חנקן. בשלב זה, הדגימות צריך להיראות נקי שכבת SAM צריך להיות בלתי נראה לעין בלתי מזוינת. סאמס מוכן בדרך זו שמישים למשך יומיים, כאשר הם מאוחסנים בתנאי קריר ויבש (25 ° C, לחות בינונית). לא מוצלחת SAM תוצאות היווצרות ציפוי מעונן או לא אחידה שאריות גוני על פני השטח.

לפברק את counterelectrode

במהלך ההתקנה קאמרית אותו בתצהיר המשמש בתצהיר microelectrode, לעשות counterelectrode ידי הפקדת 1 ננומטר של Cr, ואחריו 4 ננומטר של Au על 22 x 50 מ"מ מס '1 או מס' 0 coverslip זכוכית. Counterelectrode צריך להיות כמעט שקוף עם גוון אפור או ורוד בהיר. חנות counterelectrode מצופה בצד למעלה בצלחת פטרי כדי לשמור על נקיונו.

טובולין לפלמר לתוך MTS

1. הפשירי ללא תווית טובולין ו טובולין rhodamine ומיד לשלב ביחס של 1:02 שכותרתו ללא תווית להשיג MTS בהיר. מערבבים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. לפלמר טובולין 20-40 דקות באמבט מים חמים על 37 ° C. אורכו של MTS יהיה גדול יותר פעמים פילמור יותר. בעוד טובולין הוא polymerizing, להכין חיץ צינורות, טקסול ידי הוספת טקסול עד 20 מ"מ לתוך צינור המכיל microcentrifuge חיץ צינורות. מערבבים היטב על ידי טקסול pipetting מעלה ומטה מספר פעמים vortexing, ולאחר מכן למקם את הצינור לתוך האמבטיה מחוממת ב 37 ° C. לאחר פילמור, לדלל את MTS על ידי 1 / 100 ב חיץ צינורות, טקסול חם מגןמן האור. MTS מוכן בדרך זו יהיה להאריך לאורך זמן צרור, אשר יכול להיות מופחת על ידי דילול נוסף.
2. הכינו תערובת חמצן 10x הדחה (OS) על ידי שילוב של 30 מ"ל קר צינורות חיץ (0-4 מעלות צלזיוס), 5 מ"ל של 50% 2 ​​mercaptoethanol, 5 מ"ל גלוקוז אוקסידאז, 5 מ"ל Catalase, ו 5 מ"ל גלוקוז. ² גלוקוז יש להוסיף שעברה. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה 3-5 פעמים לאחר הוספת כל רכיב. מניחים את תערובת OS על הקרח, זה יישאר אפקטיבי למשך כ 2 שעות.
3. ודא כי פילמור MT הצליחה MTS וכי הם יציבים תחת כמה דקות של עירור הקרינה על ידי הדמיה MTS מוכן עם תערובת OS 1x. עבור הדמיה MTS מוכן בדרך זו, הקפד להשתמש בשילוב עירור / פליטה פילטר מתאים הקרינה rhodamine. קבע את דילול הטובה ביותר לעבוד חוטים בודדים על ידי הדמיה נוספת דילול MTS על ידי 1 / 10 to 1 / 100 באמצעות צינורות חיץ הדמיה בתערובת OS 1x.
4. הכינו תא תזרים ידי הרבדה גדול (22 x 50 מ"מ) קטן (22 x 22 מ"מ) coverslip זכוכית עם שתי חתיכות של נייר דו צדדית להציב 2-3 מ"מ זה מזה. הקלטת היא לחתוך בקלות על ידי הצבת אותו בשקופית זכוכית חיתוך בסכין גילוח לרצועות. הציגו microliters כמה של MTS לתוך התא זרימה באמצעות micropipette. עבור הדמיה בהגדלה גבוהה, המטרות למרחקים ארוכים עובד עשוי להידרש הדמיה פני השטח העליון של תא את הזרימה. המרחק מפני השטח coverslip / המדגם על פני השטח העליון של החדר תזרים נקבעת על ידי עובי של הקלטת ויש 60-100 מ"מ.

תבנית MTS באמצעות אלקטרופורזה

1. הכן תא אלקטרופורזה על ידי הצבת שתי רצועות דקות של סרט דו צדדית על פני המדגם בדוגמת, SAM מצופה כזה האלקטרודה הוא בין רצועות עם השביל המחבר פועל בניצב הקלטת (איור 2). מניחים את counterelectrode בקלטת דו צדדית עם הצד מתכת נגיעה סרט כזה קצה של הסככות המדגם counterelectrode בכ 3 מ"מ (איור 2). גזור מספר 15 ס"מ באורך של חוטי נחושת מבודדים מגנט רצועה 1 ס"מ של בידוד מעל קצותיו. צרף חוט לאזור Au חשוף של המצע באמצעות טיפה קטנה של צבע כסף בזמן נטילת הטיפול, כדי למנוע יצירת קשר חשמלי עם counterelectrode (זה ניתן לבדוק עם מודד). צרף חוט השני counterelectrode באמצעות צבע כסף. מחוברים חוטים בצבע כסף יכול להיות מאובטח נוספת דגימות עם הקלטת.
   
   2. תרשים זרימה תא הרכבה עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.
2. הציגו MTS בדילול הרצוי באמצעות צינורות חיץ בשילוב עם מערכת ההפעלה בריכוז 1x הסופי. תמונה בהגדלה של 20X ולאתר את התבנית על פרוסות סיליקון סיליקון לפני החלת מתח. לחלופין, החדר הזרימה יכולה להיות חתומה באמצעות לק כדי למנוע זרימת הנוזל והגירה MT במישור של החדר לזרום.
3. החלת מתח עד V 1 ולבחון ההגירה של MTS. מתח נמוך (עד כ - 0.5 V) עשוי לשמש אם השמנה הפיך של MTS הוא הרצוי, אך זה דורש איטום תא זרימה כדי למנוע סחף לרוחב. לק עובד היטב עבור איטום קצוות פתוחים של החדר לזרום. במתח מעל כ 0.7 V, הידבקות כמה MT ניתן לראות על דפוס, למרות שזה יהיה חלש. במתח מעל כ 0.9 V, ההגירה MT יהיה מהר יותר, הידבקות יהיה חזק יותר. מעל כ 1.2 V את הסבירות עבור אלקטרוליזה גרימת (היווצרות בועות גז) וגם להרוס את microelectrodes מגדילה באופן משמעותי. הגירה ניתן לעקוב באמצעות התאמת המטוס אנכית של מוקד המיקרוסקופ. אם בוצע כהלכה, MTS יהיה למקם על משטחים אלקטרודה.

Discussion

הגירה של MTS היא דמיינו בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בגלל הבהירות שלהם ואת הקרינה רקע נמוך. השיטה היא בדרך כלל החל על דפוסים biomolecule, כמו זה רק דורש כי ביומולקולות להיגרם לשאת מטען נטו על ידי התאמה של pH מתאים החיץ. Electroosmosis היא להימנע ההתקנה זה כי אין משטחים טעונים כגון קירות סיליקה בשימוש אלקטרופורזה נימי.

כמה שינויים של שיטה זו הם אפשריים. איטום קצוות החדר זרימה הוא קריטי כדי לצפות הפיכות בשל התאדות מקצות פתוח גורם זרימת נוזלים בצובר והגירה MT רצויים. חמצון של פרוסות סיליקון לפני דפוסים ליתוגרפיות ימנע הולכה דרך המצע, המאפשר אלקטרודות מרובות עם פוטנציאל עצמאי לשמש בעת ובעונה אחת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7	6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Acetone	EMD Millipore	AX0120-8	ACS grade
Catalase	Calbiochem	219001-5MU
Chlorobenzene	EMD Millipore	MK441908	ACS grade
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Calbiochem	324626
Glucose	EMD Millipore	DX0145-1
Glucose oxidase	MP Biomedicals	100330
Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP)	Jena Biosciences, GmbH	NU-405s
Guanosine-5’-triphosphate	Sigma-Aldrich	G8752
Isopropanol	EMD Millipore	PX1835-5	ACS grade
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	Fisher Scientific	AC12739-0010
Paclitaxel (taxol)	Calbiochem	580555
Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P1851
Polymethylmethacrylate (PMMA)	Brewer Science, Inc.	950K	molecular weight 950K
Rhodamine tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T331M	from bovine brain 99% pure, lyophilized
Toluene	EMD Millipore	TX0735-5	ACS grade
Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T238	from bovine brain 99% pure, lyophilized
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies.