Antifouling самоорганизующихся монослоев на микроэлектродов для структурирования биомолекул

Summary

Мы представляем порядок формирования поли (этиленгликоля) самоорганизующихся монослоя (ПЭГ-SAM) на кремниевую подложку с золотыми микроэлектродов. PEG-SAM формируется в один шаг и предотвращает обрастания на кремний и золото поверхностей. Электрофорез затем используется для структурирования биомолекул до наноразмерных.

Abstract

Мы представляем порядок формирования поли (этиленгликоля) (ПЭГ) trimethoxysilane самоорганизующихся монослоя (SAM) на кремниевую подложку с золотыми микроэлектродов. PEG-SAM формируется в одном шаге сборки и предотвращает обрастания на кремний и золото поверхностей. SAM используется для покрытия микроэлектродов с узором стандарт, положительный тон литографии. Использование микротрубочек в качестве примера, мы применяем постоянное напряжение, чтобы вызвать электрофоретической миграции в SAM-покрытым электродом в обратимым образом. Проточную камеру используется для работы с изображениями электрофоретической миграции и микротрубочек структурирование

Protocol

Подготовка реагентов

Подготовка ТРУБЫ буфера (80 мМ ТРУБЫ, 1 мМ MgCl _2, 1 мМ EGTA, доводили до рН 6,8 с КОН). Алиготе и оксидазы глюкозы магазина, каталазы и глюкозы при -70 ° С и таксола при температуре -20 ° C в соответствии с существующими протоколами. ^1,2 Алиготе и хранить тубулина при -70 ° С в соответствии с инструкциями поставщика.

Pattern Au микроэлектродов использованием литографии

1. Вырезать кремниевых пластин в 1 см 1,5 см подложках с использованием писца или пластины катер. Чистая подложках, размещая их в стакан с ацетоном достаточно, чтобы покрыть их и разрушать ультразвуком в течение 5 минут. Без позволяет подложки для просушки, промойте их в пресной ацетон, затем сразу же промыть в изопропанола и сухой с использованием азота.
2. Изготовление Au микроэлектродов на чистую подложках с использованием стандартных, позитивный тон фотолитографии или электронно-лучевой литографии, в зависимости от размера функций лучшего. ³ При разработке шаблона геометрии, держать диаметр каждого электрода образец ниже 100 микрон для обеспечения покрытия PEG SAM (описанные в следующем разделе). Включите контактных площадок (~ 300 мм ²⁾ позиционируется от 300 до 500 мм от образца с 1 мм линии, соединяющей площадку с электродами (рис. 1). Место литографические шаблоны около середины подложки, чтобы пространство вокруг шаблон для сборки проточную камеру.
   
   Рисунок 1. Пример геометрии. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.
3. После разработки шаблона в слой резиста, скретч-линии в сопротивляются от контактной площадки на краю подложки с помощью пинцета (рис. 1). После осаждения металла, царапины позволит электрического контакта между электродом и края подложки. Осаждения камеру, желательно с двух источников, используется для нанесения слоя металла. Электродов образуются отложения 2 нм Cr (для адгезии) с последующим 6 нм золота, не нарушая вакуума. Кварцевых микровесов кристалл оборудованный внутри камеры может быть использован для измерения толщины пленок в процессе осаждения.

Подготовка SAM

1. Разогреть духовку и в хорошо проветриваемом помещении до 75 ° C. Подготовка silanization решение, добавив 20 мл толуола в 250 мл стакан стекло. Затем добавить 1 мл ПЭГ-силана (например, 5% об / об) в толуоле использованием пластиковой пипетки. Смешайте в ПЭГ-силана также с помощью пипетки вверх и вниз от 5 до 10 раз, а затем перемешивание с помощью пипетки на 30 секунд.
2. Место узорные образцы в стакан с узорной стороны вверх, убедившись, что они полностью погружены в ПЭГ-силана растворе толуола и равномерно расположенных по всей нижней части стакана. Место стакан в духовку и выпекать 18 до 21 часов при 75 ° C. Хотя SAM является формирование, подготовку противоэлектрода (см. ниже) и собрать любые дополнительные компоненты, необходимые для оставшихся шагов.
3. После 18-21 часов в духовке, толуол должен испариться оставив узорные образцы в вязкой PEG-силана остатка. Добавьте 20 мл толуола в стакан и замочить образцы в течение 1-2 минут. Удалить образцы стакан и промыть толуола, затем изопропанол, и, наконец, сухим азотом. На данный момент, образцы должны выглядеть чистым и слой SAM должна быть невидимым для невооруженного глаза. ЗРК подготовлена ​​таким образом могут использоваться в течение двух дней при хранении в прохладных сухих условиях (25 ° С, умеренная влажность). Неудачный формирование SAM приводит к облачной или неравномерного оттенка покрытия остатков на поверхности.

Изготовление противоэлектрода

В той же установке камеры осаждения используется для осаждения микроэлектрода, сделать противоэлектрода путем сдачи на хранение 1 нм Cr, затем 4 нм Au на 22 х 50 мм, № 1 или № 0 покровное стекло. Противоэлектрода должна быть почти прозрачными светло-серый или розовый оттенок. Магазин противоэлектрода покрытием стороной вверх в чашке Петри, чтобы держать его в чистоте.

Полимеризации тубулина в МЦ

1. Оттепель немеченого тубулина и родамина тубулина и немедленно объединить в соотношении 1:2 маркированы, чтобы немеченого получить яркие МТС. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Полимеризации тубулина в течение 20-40 минут в нагретой водяной бане при температуре 37 ° C. Длина МЦ будет больше через более длительное время полимеризации. Хотя тубулина является полимеризации, подготовить ТРУБЫ-таксола буфер добавлением таксола до 20 мм в микроцентрифужных пробирку ТРУБЫ буфера. Смешайте таксола также с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, и вортексе, а затем поместить трубку в нагретой бане при температуре 37 ° C. После полимеризации, развести МЦ по 1 / 100 в теплой ТРУБЫ-таксола буфера и щитаот света месте. МЦ подготовлена ​​таким образом, будет удлиненное с течением времени и расслоения, которое может быть уменьшена на дальнейшее разведение.
2. Подготовка 10x поглощающего кислород смеси (ОС) путем объединения 30 мл холодного буфера ТРУБЫ (0-4 ° С), 5 мл 50% 2-меркаптоэтанол, 5 мл глюкозы оксидазы, каталазы 5 мл и 5 мл глюкозы. ² глюкозы должны быть добавлены в последнюю очередь. Смешать с помощью пипетки вверх и вниз 3-5 раз, после добавления каждого компонента. Поместите смесь ОС на льду, он будет оставаться эффективным в течение приблизительно 2 часов.
3. Убедитесь, что полимеризация MT прошла успешно и МЦ устойчивы относительно нескольких минут возбуждения флуоресценции от изображения подготовлены МЦ с микс 1x ОС. Для визуализации МЦ Подготовленный таким образом, не забудьте использовать возбуждение / излучение комбинации фильтров подходят для родамина флуоресценции. Определить лучшие рабочие разведения для работы с изображениями отдельных волокон путем дальнейшего разбавления МЦ на 1 / 10 до 1 / 100 с использованием труб буфера и обработки изображений с микс 1x ОС.
4. Подготовка потока камеры сэндвич большой (22 х 50 мм) и небольшой (22 х 22 мм), стекло покровное с двумя кусками двухсторонней ленты помещается 2-3 мм друг от друга. Лента легко режется на полосы, разместив его на стекло и резка с лезвия бритвы. Ввести несколько микролитров МЦ в поток ячейку с помощью микропипетки. За высокое увеличение изображения, долгие рабочие цели расстояния могут потребоваться для работы с изображениями верхней поверхности проточную камеру. Расстояние от покровного / поверхности образца до верхней поверхности потока камеры определяется толщиной пленки и должна быть 60-100 мм.

Pattern МЦ использованием электрофореза

1. Подготовка электрофореза камеры путем размещения двух тонких полос двухсторонней ленты через рисунком, SAM-покрытием образца, что электрод между полосами с подключением путь, перпендикулярной ленты (рис. 2). Место противоэлектрода на двухсторонней ленты с металлической стороне трогательная лента так, что края образца свесы противоэлектрода примерно на 3 мм (рис. 2). Вырезать несколько 15 см длины изолированного провода магнита меди и полоса 1 см изоляцию с обоих концов. Присоединить провод к воздействию Au поверхности подложки с помощью небольшой капли серебряной краской, заботясь, чтобы избежать электрического контакта с противоэлектрода (это можно проверить с помощью мультиметра). Прикрепите второй провод к противоэлектрода использованием серебряной краской. Провода крепится серебряная краска может быть дополнительно закреплен на образцах с лентой.
   
   Рисунок 2. Проточная ячейка сборки для перевернутой флуоресцентного микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.
2. Ввести МЦ на желаемом разбавления с использованием труб буфера в сочетании с ОС на 1x конечной концентрации. Изображение на 20-кратным увеличением и найти рисунок на кремниевой пластины перед нанесением напряжения. При желании потока камера может быть запечатаны использованием лака для ногтей, чтобы предотвратить поток жидкости и МТ миграции в плоскости потока камеры.
3. Применить напряжением до 1 В и наблюдать миграцию МТС. Нижняя напряжения (примерно до 0,5 В) может быть использована, если обратимым захватом МЦ желательна, однако это требует уплотнения потока камера для предотвращения бокового дрейфа. Лак для ногтей хорошо работает для герметизации открытых концов проточную камеру. При напряжениях выше 0,7 В, некоторые адгезии MT можно увидеть на модели, хотя это будет слабым. При напряжениях выше примерно 0,9 В, миграции МТ будет быстрее, и сцепление будет сильнее. Над около 1,2 V вероятности для стимулирования электролиза (образование газовых пузырьков), а также для уничтожения микроэлектродов значительно возрастает. Миграция может быть отслежены, регулируя вертикальной плоскости фокуса микроскопа. Если выполнены правильно, МТС локализуются на поверхности электродов.

Discussion

Миграция МЦ легко визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии из-за их яркости и низкой флуоресценции фон. Метод обычно применяется к биомолекулы рисунка, и требует лишь, что биомолекулы быть вызваны для выполнения суммарный заряд с помощью соответствующих корректировка буфера рН. Электроосмоса можно избежать на этом этапе, поскольку Есть нет заряженных поверхностях, таких как диоксид кремния стен используются в капиллярного электрофореза.

Различные модификации этого метода возможны. Уплотнительная концах потока камера имеет решающее значение для наблюдения обратимости, поскольку испарение с открытых концов причиной объемного потока жидкости и нежелательной миграции МТ. Окисление кремниевой пластины до литографической структурирование будет препятствовать проводимости через подложку, что позволяет несколько электродов с независимым потенциалом, которые будут использоваться одновременно.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7	6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Acetone	EMD Millipore	AX0120-8	ACS grade
Catalase	Calbiochem	219001-5MU
Chlorobenzene	EMD Millipore	MK441908	ACS grade
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Calbiochem	324626
Glucose	EMD Millipore	DX0145-1
Glucose oxidase	MP Biomedicals	100330
Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP)	Jena Biosciences, GmbH	NU-405s
Guanosine-5’-triphosphate	Sigma-Aldrich	G8752
Isopropanol	EMD Millipore	PX1835-5	ACS grade
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	Fisher Scientific	AC12739-0010
Paclitaxel (taxol)	Calbiochem	580555
Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P1851
Polymethylmethacrylate (PMMA)	Brewer Science, Inc.	950K	molecular weight 950K
Rhodamine tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T331M	from bovine brain 99% pure, lyophilized
Toluene	EMD Millipore	TX0735-5	ACS grade
Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T238	from bovine brain 99% pure, lyophilized
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies.