Antifouling monocamadas auto-organizadas em Microeletrodos de Biomoléculas Patterning

Summary

Nós apresentamos um procedimento para a formação de um poli (etileno glicol) monocamada auto-montados (PEG-SAM) em um substrato de silício com microeletrodos de ouro. O PEG-SAM é formada em uma única etapa e impede a incrustação em superfícies de silício e ouro. Eletroforese é então utilizado para padronização biomoléculas até a nanoescala.

Abstract

Nós apresentamos um procedimento para a formação de um poli (etileno glicol) (PEG) monocamada auto-montados trimetoxissilano (SAM) em um substrato de silício com microeletrodos de ouro. O PEG-SAM é formado em uma etapa única montagem e impede a incrustação em superfícies de silício e ouro. A SAM é usada para microeletrodos casaco estampados com a norma, litografia tom positivo. Usando o microtúbulos como um exemplo, nós aplicamos uma tensão DC para induzir a migração eletroforética para o eletrodo revestido SAM de forma reversível. A câmara de fluxo é usado para geração de imagens a migração eletroforética e padronização de microtúbulos

Protocol

Preparação de reagentes

Prepare TUBOS tampão (80 mM PIPES, 1mM MgCl _2, 1 mM EGTA, ajustado para pH 6,8 com KOH). Alíquotas e armazenar glicose oxidase, catalase e glicose a -70 ° C e taxol a -20 ° C de acordo com protocolos existentes. ^1,2 alíquotas e tubulina armazenar a -70 ° C de acordo com as instruções fornecidas pelo fornecedor.

Microeletrodos padrão de Au utilizando litografia

1. Corte em pastilhas de silício 1,5 1 cm 'substratos cm, utilizando um escriba ou cortador de bolacha. Limpe os substratos, colocando-os num copo com acetona o suficiente para cobri-los e sonicate por 5 minutos. Sem permitir que os substratos para secar, lave-os em acetona fresco, logo em seguida enxágüe em isopropanol e seco usando nitrogênio.
2. Au fabricar microeletrodos nos substratos limpos usando o padrão, fotolitografia tom positivo ou litografia por feixe de elétrons, dependendo do tamanho das características desejadas. ³ Ao projetar a geometria padrão, manter o diâmetro de cada padrão de eletrodo inferior a 100 microns para garantir a cobertura pela PEG SAM (descrito na próxima seção). Incluem suportes de contato (~ 300 mm ²⁾ posicionados 300-500 mm do padrão com uma linha de 1 milímetro de conectar o teclado com o eletrodo (Fig. 1). Coloque os padrões litográficos perto do meio do substrato para permitir o espaço em torno do padrão para a montagem da câmara de fluxo.
   
   Figura 1. Geometria da amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 1.
3. Após o desenvolvimento do padrão na camada de resistir, um arranhão na linha de resistir a partir do bloco de contato para a borda do substrato usando uma pinça (Fig. 1). Após a deposição de metal, do zero vai permitir o contato elétrico entre o eletrodo ea borda do substrato. A câmara de deposição, de preferência com duas fontes, é utilizado para depositar a camada metálica. Os eletrodos são formados pela deposição de 2 nm de Cr (por adesão), seguido de 6 nm de Au, sem quebra de vácuo. A microbalança de cristal de quartzo equipado dentro da câmara pode ser usada para medir a espessura dos filmes durante a deposição.

Preparar o SAM

1. Pré-aqueça o forno e em uma área bem ventilada a 75 ° C. Preparar a solução de silanização, adicionando 20 mL de tolueno para um copo de vidro de 250 ml. Em seguida, adicione 1 mL PEG-silano (ou seja, 5% v / v) para o tolueno, utilizando uma pipeta de plástico. Misture o PEG-silano bem pipetando cima e para baixo 5 a 10 vezes e depois mexendo com a pipeta de 30 segundos.
2. Coloque as amostras padrão no recipiente com o lado virado para cima padrão, certificando-se que eles são completamente submersas na solução de PEG-silano tolueno e são espaçadas ao longo do fundo do copo. Colocar o copo no forno e asse 18-21 horas a 75 ° C. Enquanto o SAM está se formando, preparar o counterelectrode (veja abaixo) e montar os componentes adicionais necessários para as etapas restantes.
3. Após 18-21 horas no forno, o tolueno deve evaporar deixando as amostras padrão em um resíduo PEG-silano viscoso. Adicionar 20 mL de tolueno para o copo e mergulhar as amostras por 1-2 minutos. Remove as amostras do copo e enxaguar com tolueno, em seguida, isopropanol, e finalmente seco com nitrogênio. Neste ponto, as amostras devem olhar limpo ea camada de SAM deve ser invisível a olho nu. SAMs preparado desta maneira são utilizáveis ​​por até dois dias, quando armazenados em local seco (25 ° C, umidade moderada). Sem sucesso SAM resultados a formação de um revestimento de resíduo nublado ou irregular hued na superfície.

Fabricar o counterelectrode

Na mesma configuração de câmara de deposição utilizado para deposição de microeletrodos, faça uma counterelectrode depositando 1 nm de Cr, seguido por 4 nm de Au para um 22 x 50 mm N º 1 ou lamela de vidro n º 0. O counterelectrode deve ser quase transparente com um tom cinzento-claro ou rosa. Armazenar os counterelectrode revestido virado para cima em uma placa de Petri para mantê-lo limpo.

Tubulina polimerizar em MTs

1. Descongelar unlabeled tubulina e tubulina rodamina e imediatamente se combinam em uma proporção de 1:2 rotulados para unlabeled obter MTs brilhante. Mix pipetando cima e para baixo várias vezes. Polimerizar a tubulina para 20-40 minutos em um banho de água aquecida a 37 ° C. O comprimento do MTs será maior por mais tempo de polimerização. Enquanto a polimerização da tubulina é, prepare um tampão PIPES-taxol, adicionando taxol a 20 mM em um tubo de microcentrífuga contendo tampão PIPES. Misture o taxol bem pipetando cima e para baixo várias vezes e vórtex, e depois colocar o tubo no banho aquecida a 37 ° C. Após a polimerização, diluir a MTs por 1 / 100 em tampão PIPES-taxol quente e escudoda luz. MTs preparada desta forma alongada ao longo do tempo e pacote, que pode ser reduzido pela diluição.
2. Prepare uma mistura de oxigênio 10x de limpeza (OS) através da combinação de 30 mL tampão PIPES fria (0-4 ° C), 5 mL de 50% 2-mercaptoetanol, 5 mL de glicose oxidase, catalase 5 mL e 5 mL de glicose. ² A glicose deve ser adicionado por último. Mix pipetando cima e para baixo 3-5 vezes após a adição de cada componente. Coloque a mistura OS no gelo, que permanecerá em vigor durante cerca de duas horas.
3. Verifique se a polimerização MT foi bem-sucedida e que o MTs são estáveis ​​sob vários minutos de excitação de fluorescência pela imagem da MTs preparado com 1x mix OS. Para geração de imagens a MTs preparado desta forma, não se esqueça de usar uma combinação de excitação / emissão de fluorescência filtro adequado para rodamina. Determinar a melhor diluição de trabalho para filamentos de imagens individuais por mais diluir a MTs por 1 / 10 a 1 / 100 com tampão PIPES e imagem com 1x mix OS.
4. Preparar uma câmara de fluxo, imprensando uma lamela de vidro de grandes dimensões (22 x 50 mm) e pequeno (22 x 22 mm) com dois pedaços de fita dupla-face colocada 2-3 mm. A fita é facilmente cortado em tiras, colocando-o sobre uma lâmina de vidro e corte com uma lâmina de barbear. Introduzir alguns microlitros de MTs na célula de fluxo, utilizando uma micropipeta. Para imagens de alta ampliação, os objectivos de longa distância de trabalho podem ser necessárias para geração de imagens da superfície superior da câmara de fluxo. A distância entre a superfície lamela / amostra até a superfície superior da câmara de fluxo é determinado pela espessura da fita e deve ser 60-100 mm.

Padrão de MTs por eletroforese

1. Prepare uma câmara de eletroforese, colocando duas tiras finas de fita dupla face em toda a amostra padrão, SAM-revestido de tal forma que o eletrodo está entre as tiras com o caminho de ligação perpendicular à fita (Fig. 2). Coloque o counterelectrode na fita dupla-face com o lado do metal tocar a fita de modo que a borda da amostra overhangs o counterelectrode por cerca de 3 mm (Fig. 2). Cortar vários comprimentos de 15 centímetros do fio de cobre isolados ímã e tira um centímetro do isolamento fora de ambas as extremidades. Anexar um fio para a área de Au exposta do substrato usando uma pequena gota de tinta prata tendo o cuidado de evitar fazer contato elétrico com o counterelectrode (isso pode ser verificado com um multímetro). Anexar um segundo fio à counterelectrode usando a pintura prata. Fios ligados com tinta de prata pode ser ainda mais segura para as amostras com fita.
   
   Figura 2. Montagem de células de fluxo para um microscópio invertido de fluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.
2. Introduzir MTs na diluição desejada usando tampão PIPES combinado com OS em 1x de concentração final. Imagem com ampliação de 20x e localize o modelo sobre o wafer de silício antes da aplicação de uma voltagem. Opcionalmente, a câmara de fluxo pode ser selada com unha polonês para impedir fluxo de fluido e migração MT no plano da câmara de fluxo.
3. Aplicar uma tensão de até 1 V e observar a migração das MTs. Tensões mais baixas (até cerca de 0,5 V) pode ser usado se prendendo reversível de MTs é desejado, porém isto requer selando a câmara de fluxo para evitar desvio lateral. Unha polonês funciona bem para selar as extremidades abertas da câmara de fluxo. Em tensões acima de cerca de 0,7 V, cerca de adesão MT pode ser visto sobre o padrão, embora seja fraco. Em tensões acima de cerca de 0,9 V, a migração MT será mais rápido, ea adesão será mais forte. Acima de cerca de 1,2 V a probabilidade de indução de eletrólise (formação de bolhas de gás) e também para destruir o microeletrodos aumenta significativamente. A migração pode ser rastreado, ajustando o plano vertical do foco do microscópio. Se realizado corretamente, o MTs vai localizar na superfície do eletrodo.

Discussion

A migração dos MTs é facilmente visualizado através de microscopia de fluorescência por causa de seu brilho e da fluorescência de fundo baixa. O método é geralmente aplicável a padronização biomolécula, uma vez que só exige que as biomoléculas ser induzido a levar uma carga líquida pelo ajuste adequado do pH. Eletroosmose é evitada nesta configuração, porque não há superfícies carregadas como as paredes de sílica usada em eletroforese capilar.

Várias modificações deste método é possível. Vedação das extremidades da câmara de fluxo é fundamental para observar reversibilidade porque a evaporação das extremidades aberta faz com que o fluxo de fluido a granel e de migração do MT indesejáveis. Oxidação do wafer de silício antes da padronização litográfica vai impedir a condução através do substrato, permitindo múltiplos eletrodos com potenciais independente a ser usados ​​simultaneamente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-[methoxypoly-(ethyleneoxy)propyl]-trimethoxysilane (PEG-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7	6-9 PEG units;molecular weight 450-600 g mol-1
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
Acetone	EMD Millipore	AX0120-8	ACS grade
Catalase	Calbiochem	219001-5MU
Chlorobenzene	EMD Millipore	MK441908	ACS grade
Ethylene glycol-bis(2-amin–thylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Calbiochem	324626
Glucose	EMD Millipore	DX0145-1
Glucose oxidase	MP Biomedicals	100330
Guanosine-5’-[(α,Β)-methyleno]triphosphate, Sodium salt (GMPCPP)	Jena Biosciences, GmbH	NU-405s
Guanosine-5’-triphosphate	Sigma-Aldrich	G8752
Isopropanol	EMD Millipore	PX1835-5	ACS grade
Methyl isobutyl ketone (MIBK)	Fisher Scientific	AC12739-0010
Paclitaxel (taxol)	Calbiochem	580555
Piperazine-N,N’’-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P1851
Polymethylmethacrylate (PMMA)	Brewer Science, Inc.	950K	molecular weight 950K
Rhodamine tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T331M	from bovine brain 99% pure, lyophilized
Toluene	EMD Millipore	TX0735-5	ACS grade
Tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T238	from bovine brain 99% pure, lyophilized
No. 1 borosilicate glass coverslips (22 X 50 mm) were purchased from VWR. Polished electronic grade p-type <111> silicon wafers were purchased from Addison Engineering, Inc. High-purity silver paint was obtained from Structure Probe, Inc. (Catalog # 5001 AB). Insulated fine gauge copper magnet wire (~ 0.08 mm (0.003”) diameter) can be obtained from electronic supply companies.