Summary
هذا هو الحفظ بالتبريد الحيوانات المنوية عالية الإنتاجية بروتوكول للالزرد. cryopreserved الحيوانات المنوية باستخدام هذا البروتوكول يبلغ متوسط الخصوبة بنسبة 25 ٪ في التلقيح الصناعي لاحقة ومستقرة على مدى سنوات عديدة.
Abstract
هذه هي طريقة لحفظ البرودة الزرد الحيوانات المنوية التي هي التكيف مع أسلوب هارفي (هارفي وآخرون ، 1982). لدينا عرض اثنين من التغييرات على البروتوكول الأصلي أن كلا من تبسيط الإجراءات وزيادة التجانس العينة. أولا ، نحن تطبيع كافة وحدات التخزين باستخدام وسائل الإعلام تجميد الحيوانات المنوية التي لا تحتوي على cryoprotectant. يتم تخزين الثاني في الحيوانات المنوية cryopreserved cryovials بدلا من الأنابيب الشعرية. معدلات الحيوانات المنوية التجميد والذوبان (δ درجة مئوية / الساعة) هي على الأرجح أهم المتغيرين للتحكم في هذا الإجراء. لهذا السبب ، لا بديل أنابيب مختلفة لتلك المحددة. عمل في فرق من 2 فمن الممكن لتجميد الحيوانات المنوية من 100 ذكور لكل فريق في ساعات 2 ~. cryopreserved الحيوانات المنوية باستخدام هذا البروتوكول يبلغ متوسط الخصوبة 25 ٪ (مقاسا بعدد من أجنة قابلة للحياة ولدت في التخصيب في المختبر مقسوما على مجموع عدد البويضات المخصبة) وهذا الخصوبة في المئة مستقرا على مدى سنوات عديدة.
Protocol
الجزء ألف : حلول تجميد الحيوانات المنوية
1. جينسبيرج قارعو الأجراس الأسماك (الطازجة جعل كل 3 أيام ؛ غينسبرغ ، 1963)
ملاحظة : ترتيب اضافة مهم لمنع هطول الأمطار
في 450 مل العقيمة ddH2O حل :
- كلوريد الصوديوم 3.25 غ
- بوكل 0.125 غرام
- CaCl2 • 2 H2O 0.175 غرام
ثم يضيف : - NaHCO3 0.10 ز
يصل حجم النهائية الى 500 مل مع ddH2O العقيمة وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. تجميد متوسطة (جعل اليومية الطازجة)
- بدون الميثانول
- جينسبيرغ السمكية قارعو الأجراس 10 مل (درجة حرارة الغرفة).
- مسحوق الحليب الخالي من الدسم 1.5 جرام
- مع الميثانول
ملاحظة : ترتيب اضافة مهم لمنع هطول الأمطار- جينسبيرغ السمكية قارعو الأجراس 9 مل (درجة حرارة الغرفة).
- 1 مل ميثانول
- مسحوق الحليب الخالي من الدسم 1.5 غرام
تجميع وسائل الاعلام بعد تجميد وتخلط جيدا لمدة 20 دقيقة. على مدار شاكر أو الروك. قبل استخدام ، قسامة على 1 مل إيبندورف الأنابيب ، وتجنب فقاعات السطح.
الجزء باء : المواد اللازمة لتجميد الحيوانات المنوية
المواد اللازمة لتجميد الحيوانات المنوية
- 10 ماصات المتاح ميكرولتر (Fisherbrand القط # 22-358697)
- 250ml الأكواب لأسماك المياه التي تحتوي على MESAB / Tricaine
- نظارات ووتش (بيركس القط # 9985-75)
- P20 pipetman (أو ما يعادلها) ونصائح
- الاسفنج حامل السمك (لعقد من الذكور في حين الضغط)
- تشريح المجهر مع الإضاءة المرحلة أعلاه
- ملقط مسطح (على سبيل المثال نوع ميليبور)
- 2.0ml المبردة قوارير (كورنينج القط # 430488)
- 10X10 cryoboxes (Nalgene القط # 03-337 ، 7AA)
- الستايروفوم حاوية مملوءة 15 سم ~ من ice1 الجافة سحقت ناعما
- 15 مل أنابيب مخروطية (فالكون # 352099)
- قارورة ديوار التي تحتوي على النتروجين السائل
- ملقط طويل (مثل الرعاية الصحية CMS فيشر القط # 10 - 316B)
- Cryogloves
- دبابات الانتعاش للذكور
- أنبوب واحد إيبندورف شغلها مع وسائل الاعلام من دون تجميد الميثانول
- أنبوب واحد إيبندورف مليئة تجميد وسائل الاعلام مع الميثانول
- Cryofreezer (مثل تايلور ارتون K - سلسلة)
1 هناك طريقة بسيطة لصنع الثلج الجاف سحقت ناعما هو التفاف عليه في منشفة ويطحنون عليه بمطرقة. وهناك طريقة أكثر كفاءة في استخدام طاحونة الثلج الجاف ، على سبيل المثال نموذج كلوسون RE - 2.
الجزء جيم : تجميد الحيوانات المنوية الأسلوب
- MARK أنابيب شعرية : قبل بداية ، علامة الأنابيب الشعرية 10μl بالقلم مختبر على مستوى 3.33 ميكرولتر (أي 16،7 ملم من أسفل ، انظر الشكل رقم 1.1).
- ذكر تخدير : ذكر المكان (ق) في دورق يحتوي على MESAB / tricaine مخففة في أسماك المياه (وصفة في "الكتاب واسماك الزرد")
- FISH جاف : تخدير وبمجرد رفع الأسماك من مخدر باستخدام ملعقة بلاستيكية وصمة عار بلطف السمك الجاف على منشفة ورقية ، مع إيلاء اهتمام خاص لتجفيف الجانب البطني. المياه تنشيط الحيوانات المنوية ولذلك فمن المهم أن يجف تماما حول مجرور. الأسماك موقف حامل الإسفنج ، بطني حتى الجانب (الشكل 1.2). إذا المنطقة المحيطة الزعنفة الشرجية لا تزال رطبة وجافة بلطف مع kimwipe. الحرص على عدم الضغط على الحيوانات المنوية قبل الأوان!
- شهد مكان الأنابيب الشعرية في فمه ماصة مطاطية محول الذي تم تضمينه مع الأنابيب الشعرية. محول هو خرطوم مطاطي يحتوي على بوق على نهاية واحدة وحامل الشعرية من ناحية أخرى. بدلا من ذلك ، يمكن توصيل الأنابيب الشعرية إلى حقنة هاميلتون 50μl عبر قطعة قصيرة من أنابيب قطرها tygon من مناسبة.
- ذكر مكان ضمن نطاق وفضح افتتاح البولي التناسلي عن طريق نشر بعناية باستخدام زعانف الحوض باستثناء نهاية الأنبوب الشعرية.
- COLLECT الحيوانات المنوية : طرد الحيوانات المنوية بواسطة التمسيد برفق على جانبي السمك مع ملقط السلس (مثل ميليبور) ، أو عن طريق الضغط بلطف على الجانبين من الأسماك بين السبابة والإبهام الخاص. جمع الحيوانات المنوية في أنبوب شعري كما هو طرد باستخدام طيف الامتصاص (الشكل 1.2). تجنب البراز التي لا يجوز طرد مع الحيوانات المنوية.
- التطبيع حجم الحيوانات المنوية إلى 3.3 ميكرولتر : إذا كان يصل حجم الحيوانات المنوية ، أو يتجاوز علامة القلم على أنبوب شعري (أي 16.7 مم أو أكبر) ، ثم الشروع في الخطوة 8. إذا كان حجم الحيوانات المنوية لا تصل إلى حجم الهدف ، ثم تطبيع حجم القلم للاحتفال به متوسطة تجمد من دون الميثانول (الشكل 1.3). الحد الأدنى من الحيوانات المنوية يكون مقبولا يختلف مع نوعية الحيوانات المنوية. الحيوانات المنوية الجيدة هي بيضاء وشفافة. الحيوانات المنوية الفقراء يبدو مائي. بشكل عام ، ونحن نقبل على الحد الأدنى : 1 الحيوانات المنوية الجيدة ميكرولتر (أو 1 / 3 الهدف) و 2 ميكرولتر الفقراء الحيوانات المنوية (أو 2 / 3 الهدف). هو الآن حجم تطبيع إلى 3.3 ميكرولتر.
- ADD TO CRYOPROTECTANT الحيوانات المنوية : تمتص متوسطة التجميد مع Mالإيثانول إلى العلامة البرتقالية (حوالي حجم إجمالية تبلغ الآن 20 ميكرولتر ؛ الشكل رقم 1.4). خليط طرد الحيوانات المنوية وcryoprotectant على منطقة نظيفة من الزجاج ووتش ، مع إيلاء اهتمام خاص لعدم تقديم الفقاعات. المزيج بلطف صعودا ونزولا pipetting ~ 4 مرات (تجنب إدخال فقاعات).
- مكان 10μl الحيوانات المنوية في كل من 2 CRYOVIALS : الماصة 10 ميكرولتر من الحيوانات المنوية : حل cryoprotectant في قاع اثنين من cryovials منفصل التي تم المسمى مع المعلومات ذات الصلة (الشكل 1.5). تتحرك بسرعة ، وغطاء قنينة وإفلاتها في الجزء السفلي من درجة حرارة الغرفة 15 مل فالكون أنابيب واحد cryovial / أنبوب. فالكون سقف أنبوب وإدراج زوج من أنابيب فالكون cryovial المحتوية على الثلج الجاف في سحقهم.
- تجميد الحيوانات المنوية لمدة 20 دقيقة. على الثلج الجاف : الثلج الجاف يجب أن يكون في شكل مسحوق ناعم ، وليس الكريات. ينبغي أن تدرج هذه الأنابيب في الثلج الجاف عميقة بما فيه الكفاية أن تظهر فقط من القبعات (الشكل 1.6). من اجل الحفاظ على مسار الأنابيب في الثلج الجاف ، وإعطاء كل زوج من أنابيب فالكون رقم من 1-20 (مكتوبة على القبعات) وتسجيل الوقت الذي يذهب في الثلج الجاف.
- CRYOVIALS المكان الى النتروجين السائل : بعد أن تم تجميد الحيوانات المنوية على الجليد الجاف لمدة 20 دقيقة ، ونقلهم إلى النتروجين السائل التي تحتوي على قارورة ديوار. يتم تخزين الحيوانات المنوية هنا حتى الوقت لوضع الثلاجة في النيتروجين السائل. عند وضعها في الفريزر المجمد خانات المكان ، مربع في حمام من النيتروجين السائل بحيث عينات لا تسخن. استخدام ملاقط معدنية طويلة لاسترداد قارورة من قارورة ديوار والتعامل مع cryogloves. بدلا من ذلك ، يمكن نقل cryovials مباشرة من الثلج الجاف في المربع الفريزر إذا أبقى مربع الفريزر منغمسين في النيتروجين السائل في وعاء الستايروفوم.
- cryovials تخزين على المدى الطويل في الثلاجة المبردة النيتروجين السائل. للمحافظة على سلامة الحيوانات المنوية ، فمن المهم أن يتم تخزين قوارير منغمسين في النيتروجين السائل. في تجربتنا ، القنينات المخزنة في مرحلة البخار يفقد جدوى مع مرور الوقت.
المهم سرعة! الوقت بين مضيفا ان cryoprotectant ووضع قنينة الحيوانات المنوية في الجليد الجاف (أي خطوات 6-10) ينبغي أن يكون هناك أكثر من 30 ثانية.
الجزء دال : في المختبر باستخدام الحيوانات المنوية أسلوب التسميد Cryopreserved
نجد أن هذا يعمل بشكل أفضل مع شخصين. شخص واحد ساقيها والبيض من الإناث ، بينما الشخص الآخر يذوب في الحيوانات المنوية.
- مجموعة حمام مائي إلى 33 درجة مئوية.
- إزالة cryovial من النيتروجين السائل المجمد ونقل إلى النتروجين السائل التي تحتوي على قارورة ديوار حتى جاهزة للذوبان الجليد.
- أزمة البيض من الإناث في طبق بتري 35mm البلاستيك. إذا كان ذلك ممكنا ، في محاولة للحصول على 3 براثن البيض وتجمع في صحن واحد. إذا لم تتمكن من الحصول على ثلاثة براثن جيدة في حدود 1 دقيقة من مخلب الأول الخاص بك ، ثم الشروع في الخطوة 4 (واحد مخلب جيدة كافية). تعريف مخلب جيدة :> 150 لطيفة موحد يبحث البيض (أي مصفر ، مع عدم وجود الحطام بيضاء تدل على تدهور). إبقاء الطبق بينما غطت إذابة الحيوانات المنوية.
- إزالة النيتروجين السائل من القارورة وإزالة الغطاء. فيال تزج بسرعة ~ 02/01 الطريق إلى 33 درجة مئوية حمام الماء لمدة 8-10 ثوانى.
- بسرعة إضافة درجة حرارة الغرفة 70 ميكرولتر هانكس على القارورة ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا. إضافة إلى البيض ، وعلى الفور المزيج بلطف مع تلميح ماصة.
- دون تأخير ، وتفعيل الحيوانات المنوية والبيض وذلك بإضافة 750 ميكروليتر أسماك المياه. دوامة إلى المزيج. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد 5 دقائق ، وملء الطبق مع أسماك المياه واحتضان طبق في 28 درجة مئوية. بعد 2-3 ساعات ، والعد ونقل الأجنة خصبة لأطباق 100mm (50/dish). عدد البيض العقم بحيث يمكن تحديد تواتر الإخصاب.
- تتخذ الرعاية الجيدة لليرقات! لأول 5 أيام ، وتغيير المياه يوميا وإزالة أجنة ميتة. وضع اليرقات الوحيدة التي تسبح قرب حضانة في يوم 5.
الجزء هاء : النتائج الممثل
استخدمنا هذه المنهجية crypreservation لجعل المكتبة من 8600 عينات من الحيوانات المنوية المجمدة لحراثة بين عامي 2001 و 2003. علينا أن تحسنت 106 من هذه العينات وتحديد خصوبتها. الخصوبة هي نسبة الأجنة قابلة للحياة المنتجة في التلقيح الصناعي في مقسوما على مجموع عدد البيض التي تم إخصابها مع الحيوانات المنوية المجمدة. الطازجة (غير cryporeserved) الحيوانات المنوية وعادة> الخصوبة بنسبة 95 ٪ ، ومعدل الخصوبة cryopreserved الحيوانات المنوية أقل من ذلك بكثير : ما متوسطه 29 ٪ (ن = 106 قنينة). التباين القارورة إلى قارورة كبيرة في معدلات الخصوبة ، بدءا من أقل من 1 ٪ ليصل الى 62 ٪. ويمثل هذا التغير عن طريق أشرطة خطأ كبير يمثل الانحراف المعياري في الشكل. 2. ولكن في عينات من الحيوانات المنوية لإذابة 106 تاريخ علينا مرة واحدة فقط من ذوي الخبرة 0 ٪ الخصوبة في عينات الحيوانات المنوية على حد سواء ، وفشلت في استعادة الطفرة حراثة المقابلة.
ذوبان الجليد بواسطة قارورة الحيوانات المنوية من مكتبتنا على مدى عدة سنوات (2001-2008) وقد وجدنا أن معدل الخصوبة من عينات الحيوانات المنوية المجمدة التي لا يزال هذا الأسلوبمستقرة على مر الزمن (الشكل 2). وكان متوسط معدل الخصوبة من عينات الحيوانات المنوية المجمدة المذابة في عام 2001 23.5 ٪ (على أساس عينات من الحيوانات المنوية 11) وفي عام 2008 كان 25 ٪ (على أساس عينات من الحيوانات المنوية 21).
وهناك عدد من المحققين أخرى تستخدم الآن هذا البروتوكول تجميد الحيوانات المنوية في مختبراتهم. وأفادت بعض النجاح جيدة مع معدلات الخصوبة وتقلب العينة إلى نموذج على غرار ما لاحظناه. فشلت آخرين يقال لجعل هذا البروتوكول العمل في أيديهم. نعتقد أن المصادر المحتملة للمشاكل هي :
- عدم استخدام cryovials الدقيق أو أنابيب مخروطية اقترحنا في البروتوكول ، مما يؤدي إلى أسعار مختلفة للتبريد في حين الجليد الجاف ؛
- عدم استخدام الثلج الجاف مسحوق ، مما يؤدي إلى معدل التبريد دون المستوى الأمثل ؛
- استخدام الأسماك الذكور مع الخصوبة الفقراء : يجب عليك الحصول على ما لا يقل عن 1 ميكرولتر من الحيوانات المنوية من ذكر واحد. يمكنك أيضا اختبار خصوبة الذكور التي تقوم به من التخصيب في المختبر مع الحيوانات المنوية الطازجة ، ولكن هذا يمكن أن يكون مضللا لأنه يأخذ القليل جدا من الحيوانات المنوية الطازجة للحصول على قرب الخصوبة بنسبة 100 ٪.
- باستخدام بويضات جودة شبه قياسية في التلقيح الصناعي في. استخدام أي شيء ولكن الكمال براثن يؤدي دائما إلى قرب الخصوبة 0 ٪ ، وحتى من عينات الحيوانات المنوية التي فعلا جيدة الخصوبة (استنادا إلى خصوبة القارورة مكررة).
الشكل 1. تخطيطي منهجية تجميد الحيوانات المنوية.
الشكل 2. Cryopreserved خصوبة الحيوانات المنوية لا تزال مستقرة على مر الزمن. الخصوبة في المئة من عدد الأجنة قابلة للحياة المنتجة في التلقيح الصناعي في مقسوما على مجموع عدد البويضات الملقحة التي كانت مع الحيوانات المنوية المجمدة. "ن" تشير إلى أن عدد الحيوانات المنوية قارورة cryopreserved الخصوبة التي تم اختبارها في السنة المناظرة. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. لأن كل قنينة الحيوانات المنوية من الذكور هو مختلف ، لوحظ القارورة إلى التباين القارورة.
Discussion
وهناك عدد من المحققين أخرى تستخدم الآن هذا البروتوكول تجميد الحيوانات المنوية في مختبراتهم. وأفادت بعض الخصوبة مماثلة ونفس العينة إلى أن التباين عينة لاحظناه. فشلت آخرين يقال لجعل هذا البروتوكول العمل في أيديهم. نعتقد أن المصادر المحتملة للمشاكل هي :
- عدم استخدام cryovials الدقيق أو أنابيب مخروطية اقترحنا في البروتوكول ، مما يؤدي إلى أسعار مختلفة للتبريد في حين الجليد الجاف ؛
- عدم استخدام الثلج الجاف مسحوق ، مما يؤدي إلى معدل التبريد دون المستوى الأمثل ؛
- استخدام الأسماك الذكور مع الخصوبة الفقراء : يجب عليك الحصول على ما لا يقل عن 1 ميكرولتر من الحيوانات المنوية من ذكر واحد. يمكنك أيضا اختبار خصوبة الذكور التي تقوم به من التخصيب في المختبر مع الحيوانات المنوية الطازجة ، ولكن هذا يمكن أن يكون مضللا لأنه يأخذ القليل جدا من الحيوانات المنوية الطازجة للحصول على قرب الخصوبة بنسبة 100 ٪. أكبر ، وأكثر من الذكور وعادة ما تعطي اللون بقوة أكثر أعلى جودة الحيوانات المنوية.
- باستخدام بويضات جودة شبه قياسية في التلقيح الصناعي في. استخدام أي شيء ولكن الكمال براثن يؤدي دائما إلى قرب الخصوبة 0 ٪ ، وحتى من عينات الحيوانات المنوية التي فعلا جيدة الخصوبة (استنادا إلى خصوبة القارورة مكررة).
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 HG002995 "حراثة الجينوم اسماك الزرد : نهج الوراثة العكسية" لتدابير بناء الثقة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μl disposable pipettes | Fisher Scientific | 22-358697 | |
| Watch glasses | Pyrex | 9985-75 | |
| 2 ml cryogenic vials | Corning | 430488 | |
| 10 x 10 cryoboxes | Nalge Nunc international | 03-337-7AA | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352099 | |
| Tongs | Fisher Scientific | 10-316B | |
| Cryofreezer | Taylor-Wharton | K-series | For example |
References
- Ginsburg, A. S. Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes. J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).
- Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol. Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).
