Summary
우리는 효모에서 mitochondria의 정화에 대한 신속하고 효과적인 방법을 설명
Abstract
Mitochondria ATP 생산의 주요 사이트는 진핵세포 이외의 광합성 세포에 산소 신진 대사 중에 아르
Protocol
재료 및 방법
효모 변종과 성장 조건
야생 형 변형 BY4742는 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) (1 % 효모 추출물, 펩톤 2 %, 2 % 포도당) 풍부한 YEPD 매체에서 재배되었다. 전지는 30 ° C 회전이 5시 1분의 "플라스크 볼륨 / 볼륨 매체"비율 Erlenmeyer flasks의 200 rpm으로 잡고 교양되었습니다.
원유 mitochondrial 분획의 분리
- 48 H.위한 야생 형 스트레인 BY4742 문화 1 L 그로
- 500 ML Nalgene의 원심 분리기 튜브의 문화를 하거라. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 부하와 수확 세포를 균형.
- dH2O 250 ML에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend pelleted 세포. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 세포 펠렛.
- dH2O 250 ML에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend pelleted 세포. 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 세포 펠렛.
- 세포 펠렛의 서부 유럽 표준시 무게를 결정합니다.
- DTT 버퍼 [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 전지 2 ML]에서 pelleted 세포를 Resuspend.
- 50 ML 팰컨 플라스틱 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 30 ° C. 20 분 쉐이크 70 RPM에서 튜브를 회전
- 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 세포를 수확.
- Zymolyase [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 전지 7 ML]없이 Zymolyase 버퍼에 pelleted 세포를 Resuspend.
- 상온에서 3,000 XG에서 5 분 원심 분리하여 세포 펠렛.
- Zymolyase [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 전지 7 ML]없이 Zymolyase 버퍼에 pelleted 세포를 Resuspend.
- 유리 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다.
- Zymolyase - 100T의 분말을 추가 [1 Zymolyase - 100T / G (서부 유럽 표준시 무게) 세포의 MG] 세포 현탁액 수 있습니다.
- 30 ° C. 30 분 쉐이크 70 rpm으로 세포 현탁액으로 술병 회전
- 전송 spheroplasts 인해 Zymolyase - 100T 50 - ML의 플라스틱 원심 분리기 튜브와 세포 벽의 소화에 형성했다.
- 펠렛 4 2,200 XG 8 분 원심 분리하여 spheroplasts ° C.
** 모든 후속 단계 ° C 또는 얼음 4 시에 실시한다. spheroplasts의 Suspensions는 부드럽게 organelles을 위반하지 않도록 컷 팁을 pipettes를 사용하여 처리되어야합니다 .**
- 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 세포의 6.5 ML]에서 pelleted spheroplasts을 Resuspend.
- 펠렛 4 2,200 XG 8 분 원심 분리하여 spheroplasts ° C.
- 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 세포의 6.5 ML]에서 pelleted spheroplasts을 Resuspend.
- 얼음 유리 균질 화기에 미리 차게하기 위해 세포를 전송합니다.
- 꽉 유봉을 사용하여 유봉 15 스트로크를 만들어 세포를 균질.
- 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼 1 볼륨을 추가합니다.
- 50 ML의 플라스틱 원심 튜브에 균질 spheroplasts를 전송합니다.
- 펠렛 4 1,500 XG에서 5 분 centrifuging에 의해 손상되지 않은 세포, 핵, 대형 부스러기 ° C.
- 4 3,000 XG에서 5 분 결과 뜨는을 원심 분리기 ° C.
- 4 ° C.를 XG 12,000 15 분 결과 뜨는을 원심 분리기
- 얼음처럼 차가운 균질화 버퍼에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend 펠렛 [버퍼 / G (서부 유럽 표준시 무게) 세포의 6.5 ML].
- 4 3,000 XG에서 5 분 원심 분리기 ° C.
- 4 ° C.를 XG 12,000 15 분 결과 뜨는을 원심 분리기
- 얼음처럼 차가운 SEM 버퍼 3 ML에 가만히 따르다 뜨는 및 resuspend 펠릿.
**이 정지가 mitochondria에 풍부한이지만,이 또한 endoplasmic reticulum (microsomes), 잠돌군 Zz 및 vacuoles 같은 다른 organelles가 포함되어 있습니다. 순수 mitochondria를 얻으려면,이 원유 mitochondrial 분획은 아래 설명한 바와 같이, 추가 분류를 받게 될 수 있습니다 .**
다른 organelles에 의해 오염의 mitochondria 찾아볼 수의 정화
- 베크맨 울트라 클리어 원심 튜브에 EM 버퍼에 얼음처럼 차가운 60 % 플레이스 1.5 ML (W / V)은 자당.
- 오버레이 60% (W / V) 32 %의 4 ML과 자당, 23 %의 1.5 ML 15 %의 자당 (모든 EM에서 WT / V 버퍼)의 1.5 ML.
- 15 % (W / V) 자당 위에 SEM 버퍼에 원유 mitochondrial 분수 3 ML 놓습니다.
- 4 134,000 XG (33,000 RPM) 1 H ° C.에 대한 베크맨 SW41 티 스윙 - 양동이 로터의 원심 분리기
- 60 % / 32 % 자당 인터페이스에서 그대로 mitochondria 형태는 갈색 밴드.
- 조심스럽게 mitochondrial 밴드에 도달하기 전까지 자당를 제거합니다.
- 절단 팁과 피펫을 사용하여 mitochondrial 밴드를 제거하고 MLS - 5 로터에 대한 베크맨 원심 관에 넣습니다.
- SEM 버퍼로 튜브를 입력합니다.
- 펠렛 4 30 분 10,000 XG (31,000 RPM)에서 30 분 MLS - 5 로터에서 원심 분리하여 순수 mitochondria ° C.
- 사용 가만히 따르다 뜨는피펫.
- mitochondrial 기능, mitochondrial 프로테옴 및 lipidome하고, mitochondrial DNA의 분석을위한 순수 mitochondria를 사용합니다.
시약
- DTT 버퍼 [100 MM Tris/H2SO4 (산도 9.4), 10 MM dithiothreitol] (15 ML 용)
- 1 M Tris/H2SO4 버퍼의 1.5 ML (산도 9.4)
- 1 M DTT 150 μl
- 15 ML에 볼륨
- Zymolyase 버퍼 [20 MM의 칼륨 나트륨 (산도 7.4), sorbitol 1.2 M] (100 ML에 대한)
- 1 M의 칼륨 인산 버퍼 2 ML (산도 7.4)
- sorbitol이 M 60 ML
- 100 ML에 볼륨
- 균질화 버퍼 [10 MM 트리스 / HCL (산도 7.4), sorbitol 0.6 M, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.2 % (W / V) BSA] (250 ML에 대한]
- 1 M 트리스 / HCL 버퍼 (산도 7.4) 2.5 ML
- sorbitol이 M의 75 ML
- 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 500 μl
- BSA 0.5 g
- 250 ML에 볼륨
- SEM 버퍼 [10 MM의 걸레 / 코 (산도 7.2), 250 MM의 자당, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)] (250 ML에 대한)
- 1 M의 걸레 / 코 버퍼 (산도 7.2) 2.5 ML
- 2 M의 자당의 31.25 ML
- 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 500 μl
- 250 ML에 볼륨
- EM 버퍼 [10 MM의 걸레 / 코 (산도 7.2), 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)] (250 ML에 대한)
- 1 M의 걸레 / 코 버퍼 (산도 7.2) 2.5 ML
- 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 500 μl
- 250 ML에 볼륨
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Discussion
이 방법은 효모 세포에서 순수 mitochondria의 높은 수율 격리 수 있습니다. 이 방법에 의해 정화 Mitochondria 다른 organelles에 의해 오염의 기본적 자유 및 정화 후 자신의 구조와 기능 무결성을 유지합니다. 필수 mitochondrial 프로세스 셀 - 무료 reconstitution에 적합 mitochondria 설명한 방법 산출. 이 높은 순수 mitochondria는 mitochondrial 구조와 기능, mitochondrial 프로테옴 및 lipidome과 mitochondrial DNA의 분석에도 사용될 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 CIHR과 캐나다의 NSERC에서 보조금에 의해 지원되었다. VIT는 CIHR 새로운 인베스티게이터와 게놈의 콩코디아 대학 연구 위원장, 세포 생물학 및 노화입니다.
References
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