Summary
Nós descrevemos um método rápido e eficaz para a purificação de mitocôndrias da levedura
Abstract
As mitocôndrias são o principal local de produção de ATP durante o metabolismo aeróbico em eucariotas não fotossintéticos células
Protocol
Materiais e métodos
Cepas de leveduras e condições de crescimento
A cepa do tipo selvagem BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) foi cultivado em meio YEPD rica (1% extrato de levedura, peptona 2%, 2% de glicose). Células foram cultivadas a 30 ° C com rotação agitação a 200 rpm em Erlenmeyers em um "volume frasco de volume / médio" proporção de 5:1.
Isolamento da fração mitocondrial crude
- Crescer 1 L da cultura BY4742 tipo selvagem tensão por 48 h.
- Despeje cultura em 500 ml tubos de centrífuga Nalgene. Equilibrar a carga e células de colheita por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Determinar o peso úmido de pellet celular.
- Ressuspender as células peletizada na TDT buffer [2 ml de células (peso úmido) buffer / g].
- Transferir a suspensão de célula para 50 ml, tubos de plástico Falcon.
- Girar os tubos a 70 rpm em um agitador por 20 min a 30 ° C.
- Células colheita por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células em tampão Zymolyase peletizadas sem Zymolyase [7 ml de células (peso úmido) buffer / g].
- Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
- Ressuspender as células em tampão Zymolyase peletizadas sem Zymolyase [7 ml de células (peso úmido) buffer / g].
- Transferência de suspensão de células para um balão de vidro.
- Adicionar o pó de Zymolyase-100T [1 mg de células (peso úmido) Zymolyase-100T / g] para a suspensão de células.
- Gire o frasco com suspensão de células em 70 rpm em um agitador por 30 min a 30 ° C.
- Esferoplastos transferência formado devido à digestão da parede celular com Zymolyase-100T de 50 ml, tubos de centrífuga de plástico.
- Pellet esferoplastos por centrifugação por 8 min a 2200 xg, a 4 ° C.
** Todas as etapas subseqüentes devem ser realizados a 4 ° C ou em gelo. Suspensões de esferoplastos devem ser manuseados com cuidado usando pipetas com pontas cortadas para evitar a quebra organelas .**
- Ressuspender esferoplastos peletizada na gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g].
- Pellet esferoplastos por centrifugação por 8 min a 2200 xg, a 4 ° C.
- Ressuspender esferoplastos peletizada na gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g].
- Transferência de células para um pré-refrigeradas em gelo copo homogeneizador.
- Usando um pilão apertado, homogeneizar as células, fazendo 15 batidas do pilão.
- Adicionar um volume de gelada tampão de homogeneização.
- Transferência esferoplastos homogeneizada a 50 ml tubos de centrífuga de plástico.
- Pellet as células intactas, núcleos e partículas grandes por centrifugação por 5 min a 1500 xg, a 4 ° C.
- Centrifugar o sobrenadante resultante para 5 min a 3000 xg, a 4 ° C.
- Centrifugar o sobrenadante por 15 min a 12000 xg, a 4 ° C.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender em pellet gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g].
- Centrifugar por 5 min a 3000 xg, a 4 ° C.
- Centrifugar o sobrenadante por 15 min a 12000 xg, a 4 ° C.
- Decantar o sobrenadante e ressuspender pellet em 3 ml de gelado de buffer SEM.
** Embora esta suspensão é enriquecido na mitocôndria, que também contém outras organelas como o retículo endoplasmático (microssomos), Golgi e vacúolos. Para obter a mitocôndria pura, esta fração de petróleo mitocondrial pode ser submetido a fracionamento ainda, conforme descrito abaixo .**
Purificação de mitocôndrias desprovida de contaminação por outras organelas
- Ml lugar de 1,5 gelada 60% (w / v) de sacarose na EM tampão em um tubo de centrífuga Beckman Ultra-Clear.
- Sobreposição de 60% (w / v) de sacarose, com 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23%, 1,5 ml de sacarose 15% (todos tampão wt / v em EM).
- Coloque 3 ml da fração mitocondrial em bruto SEM tampão em cima de 15% (w / v) de sacarose.
- Centrífuga em uma Ti SW41 rotor Beckman balançando-balde por 1 hora a 134.000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C.
- A mitocôndria forma intacta uma faixa marrom na interface de sacarose 60% / 32%.
- Remova cuidadosamente sacarose até chegar a banda mitocondrial.
- Retire a banda mitocondrial utilizando uma pipeta com uma ponta de corte e colocá-lo em um tubo de centrífuga Beckman para um rotor-5 MLS.
- Encha o tubo com tampão de SEM.
- Pellet as mitocôndrias pura por centrifugação em um rotor MLS-5 para 30 min a 10.000 xg (31.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C.
- Decantar o sobrenadante usandouma pipeta.
- Use as mitocôndrias pura para a análise de funções mitocondriais, proteoma mitocondrial e lipidome e DNA mitocondrial.
Reagentes
- TDT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitol] (para 15 ml)
- 1,5 ml de um tampão Tris/H2SO4 M (pH 9,4)
- 150 mL de 1 M DTT
- Volume para 15 ml
- Zymolyase tampão [20 mM fosfato de potássio (pH 7,4), 1,2 M sorbitol] (para 100 ml)
- 2 ml de um tampão fosfato de potássio M (pH 7,4)
- 60 ml de 2 M sorbitol
- Volume de 100 ml
- Tampão de homogeneização [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (para 250 ml]
- 2,5 ml de 1 M Tris / HCl (pH 7,4)
- 75 ml de 2 M sorbitol
- 500 mL de 500 mM EDTA
- 0,5 g de BSA
- Volume para 250 ml
- SEM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM de sacarose, 1 mM EDTA] (para 250 ml)
- 2,5 ml de 1 MOPS M / buffer KOH (pH 7,2)
- 31,25 ml de 2 M de sacarose
- 500 mL de 500 mM EDTA
- Volume para 250 ml
- EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (para 250 ml)
- 2,5 ml de 1 MOPS M / buffer KOH (pH 7,2)
- 500 mL de 500 mM EDTA
- Volume para 250 ml
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Discussion
Este método permite o isolamento de alto rendimento de mitocôndrias puro de células de levedura. Mitocôndrias purificadas por esse método são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação. O método descrito rendimentos mitocôndrias, que são adequados para células livres reconstituição de processos essenciais mitocondrial. Estas mitocôndrias altamente puro pode também ser usado para a análise da estrutura mitocondrial e funções, proteoma mitocondrial e lipidome e DNA mitocondrial.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por concessões do CIHR e NSERC do Canadá. VIT é um CIHR New Investigator e Concordia University, em Cátedra de Investigação Genómica, Biologia Celular e Envelhecimento.
References
- Voet, D., Voet, J. G.
- Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J.
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &, Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).
- Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T.
