Summary
Zebrafish कोशिका प्रत्यारोपण ऊतक विशिष्ट chimeras उत्पन्न आनुवंशिकी और भ्रूणविज्ञान के संयोजन में सक्षम बनाता है. इस वीडियो को दर्शाता है गेसट्रुला सेल प्रत्यारोपण कि हमारी प्रयोगशाला astroglial और अग्रमस्तिष्क में commissure गठन के दौरान आबादी विशिष्ट मार्गदर्शन cues की भूमिका की जांच करने के लिए अनुमति दी है का मंचन किया.
Abstract
विकास जीव विज्ञान के क्षेत्र में कुछ मौलिक सवाल केवल जब कोशिकाओं को उपन्यास के वातावरण में रखा जाता है या जब एक बड़े संदर्भ में कोशिकाओं के छोटे समूहों बदल रहे हैं उत्तर दिया जा सकता है. देखना कैसे एक कक्ष के साथ सूचना का आदान प्रदान और एक अद्वितीय वातावरण में व्यवहार सेल कार्यों निस्र्पक के लिए आवश्यक है. निर्धारित है कि कैसे एक विशिष्ट प्रोटीन कोशिकाओं के आसपास के प्रभावों के स्थानीयकृत misexpression भूमिकाओं कि प्रोटीन विकास प्रक्रियाओं की एक किस्म में खेलता है पर व्यावहारिक जानकारी प्रदान करता है है. हमारी प्रयोगशाला zebrafish मॉडल प्रणाली का उपयोग करता है विशिष्ट शास्त्रीय प्रत्यारोपण तकनीक के साथ आनुवंशिक दृष्टिकोण गठबंधन genotypic या प्ररूपी chimeras उत्पन्न करने के लिए. हम zebrafish में अग्रमस्तिष्क commissures के गठन के दौरान न्यूरॉन glial सेल बातचीत का अध्ययन. यह वीडियो एक तरीका है कि हमारी प्रयोगशाला diencephalon में astroglial आबादी और विशिष्ट मार्गदर्शन संकेत है कि पेश axons प्रभाव के रूप में वे midline पार की भूमिका की भूमिका की जांच करने की अनुमति देता है का वर्णन. उनके पारदर्शिता zebrafish भ्रूण के कारण अस्थानिक सेल प्लेसमेंट या स्थानीयकृत जीन misexpression के इस प्रकार के लिए आदर्श मॉडल हैं. ट्रैकिंग प्रतिरोपित कोशिकाओं को एक महत्वपूर्ण डाई या एक ट्रांसजेनिक मछली एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त लाइन का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है. हम यहाँ प्रदर्शन कैसे दाता भ्रूण प्रत्यारोपण के लिए एक महत्वपूर्ण डाई अनुरेखक के साथ तैयार करने के लिए, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैसे निकालने और गेसट्रुला दूसरे करने के लिए भ्रूण मंचन से कोशिकाओं का प्रत्यारोपण. हम zebrafish भ्रूण की अग्रमस्तिष्क भीतर अस्थानिक + GFP ट्रांसजेनिक कोशिकाओं दिखा डेटा मौजूद है और commissures अग्रमस्तिष्क सम्मान के साथ इन कोशिकाओं का स्थान चिह्नित. इसके अलावा, हम स्कैनिंग लेजर confocal timelapse माइक्रोस्कोपी Alexa 594 लेबल + GFP ट्रांसजेनिक मेजबान भ्रूण में प्रत्यारोपित कोशिकाओं के दिखाते हैं. इन आंकड़ों सबूत है कि गेसट्रुला मंचन प्रत्यारोपण अस्थानिक कोशिकाओं के लक्षित स्थिति विकास जीवविज्ञान में सवालों की एक किस्म का पता करने के लिए सक्षम बनाता है प्रदान करते हैं.
Protocol
भाग 1: Alexa 594 लेबल भ्रूण
1.1 Microinjection प्लेट और सुई तैयार
- Microinjection प्लेटें बनाना
- इंजेक्शन Westerfield, 2007 1 द्वारा एक agarose एक तकनीक का उपयोग कर मोल्ड के भीतर तीन के पाँच 1 मिमी troughs शामिल प्लेटें तैयार. ये troughs snuggly कुशल और व्यवस्थित microinjections के लिए एक पंक्ति में भ्रूण का आयोजन करेगा. प्लेटें बनाने से पहले करने के लिए, तीन 1 मिमी ले, 4 इंच लंबे गैर रेशा capillaries और ध्यान से उन्हें आधे में तोड़. इन 2 इंच लंबे capillaries के superglue, दो गोंद का प्रयोग पक्ष द्वारा साइड एक सपाट सतह पर. गोंद तीसरे इन दोनों के ऊपर, ग्रोव में nestled पर केशिका, तीन capillaries के साथ एक पिरामिड आकार बनाने. सूखी और दोहराएँ जब तक पर्याप्त "गर्त molds के" का निर्माण कर रहे हैं अनुमति दें.
- पिघला हुआ 1.5% agarose 20 25ml (5mm गहराई) भ्रूण माध्यम में (EM) डालो [5mm NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl 2, 0.33mM MgSO 4 और .००,००३% methylene नीले] एक 100mm पेट्री डिश में. तुरंत मोल्ड पेट्री डिश के नीचे छू रहा है के फ्लैट पक्ष सुनिश्चित करने के प्लेट के नीचे से तीन पहले किए गए पिरामिड के आकार का गर्त molds के पांच जगह और पूरी तरह से agarose द्वारा कवर किया.
- जब agarose जम गया है, कांच केशिका molds के बाहर लिया जाना चाहिए. निकालने के लिए, एक बड़े agarose तीन केशिका नए नए साँचे युक्त वर्ग में कटौती. धीरे कटौती वर्ग और त्यागने की परिधि पर अगर हटाना. वर्ग अगर अधिक टुकड़ा और फ़्लिप, ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए, पूरी तरह से गर्त molds के हटा दें. पेट्री डिश में पिघला हुआ agarose वर्ग के आसपास जगह में नव ढाला कुओं पकड़ डालो. सेट चलो. प्लेट्स parafilm डिग्री सेल्सियस सील और 4 सप्ताह के लिए संग्रहीत किया जा सकता है अगर में किसी भी वृद्धि के संकेत को त्यागें.
- Microinjections के लिए सुई.
- एक Micropipet केशिका खींचने के लिए आवश्यक इंजेक्शन सुई से बाहर कर आंतरिक फिलामेंट के साथ 1 मिमी, 4 इंच कांच capillaries का उपयोग करें. सुई 550 का एक गर्मी के साथ Flamming / ब्राउन Micropipet डांड़ी का उपयोग कर खींच रहे थे, 120 के बल, 200 के वेग, और समय / 200 की देरी खींच.
1.2 भ्रूण संग्रह और Microinjection उपकरण सेटअप
- निषेचित अंडे तुरंत बाद वे निर्धारित कर रहे हैं और EM के साथ भरा एक पेट्री डिश में रखा एकत्र कर रहे हैं. फ्लोरोसेंट dextrans इंजेक्शन एक सेल मंच पर आदर्श है और 16 सेल चरण 2 के द्वारा पूरा किया जाना चाहिए है.
- एक विस्तृत टिप कांच विंदुक का प्रयोग, एक कमरे के तापमान इंजेक्शन EM के साथ भरी थाली के कुओं में भ्रूण को निष्कासित. धीरे troughs की तल में लगा हुआ कुंद संदंश के साथ भ्रूण पच्चर. भ्रूण chorion या जर्दी समझौता किया गया है जिसका त्याग किया जाना चाहिए.
- 1 पतला फ्लोरोसेंट Alexa 594 समाधान के 2μl (0.2 एम KCl में वजन से 5%) के साथ इंजेक्शन सुई लोड. Dextran केशिका कार्रवाई द्वारा एम्बेडेड इंजेक्शन सुई की लंबाई चल फिलामेंट के कारण इंजेक्शन सुई की नोक के लिए यात्रा करने की अनुमति दें.
- एक stereotactic micromanipulator के केशिका धारक इंजेक्शन सुई संलग्न.
- Microinjector तंत्र पर दबाव 40-50 साई और 500msec के स्पंद अवधि के साथ शुरू करने को समायोजित करें.
- धीरे इंजेक्शन सुई की नोक चरने संदंश (आदर्श व्यास 0.05 0.15mm है) के साथ सील तोड़ने के लिए. एक steromicroscope का प्रयोग, खनिज तेल के साथ एक micrometer पर dextran के ऊपर निष्कासित सुई जांचना. नाड़ी की हवा के दबाव की अवधि, और सुई की नोक के आकार का समायोजन करके सांस आकार संशोधित करें. एक सांस में 0.8-1nl की मात्रा के बराबर आकार 3 इंजेक्शन भर में बनाए रखा जाना चाहिए. अक्सर सुझावों की जर्दी कणों के साथ भरा हो जाएगा, दबाव समायोजन या सुई टिप को तोड़ने समस्या को कम कर सकते हैं, अन्यथा एक नया इंजेक्शन सुई लोड किया जाना चाहिए.
प्रतिदीप्त Alexa 594 के 1.3 Microinjections
- उच्च वृद्धि के तहत गर्त के एक छोर से शुरू पियर्स, सुचारू chorion और भ्रूण की कोशिका झिल्ली जर्दी में दर्ज करने के लिए. सेल के तहत बस dextran समाधान इंजेक्षन. भ्रूण में प्रवेश के लिए इस्तेमाल किया वही चिकनी आंदोलन के साथ इंजेक्शन सुई निकालने के लिए सुनिश्चित करें. पेट्री डिश को स्थानांतरित करने के लिए अगले भ्रूण इनलाइन स्थिति और नीचे गर्त की लंबाई इंजेक्शन जारी है. दबाव और सांस आकार समय - समय पर जाँच करें. करने के लिए कदम नहीं है या इंजेक्शन सुई मोड़ जब यह भ्रूण में है के रूप में इस fatally भ्रूण और / क्षति या इंजेक्शन सुई टूट की संभावना है सावधान रहो.
- धीरे भ्रूण संदंश के साथ troughs की बाहर धक्का. उन्हें एक पेट्री एंटीबायोटिक पेन के साथ भरा पकवान स्थानांतरण / चरण EM के रूप में वर्णित Nusslein Volhard और (2002) Dahm (1ml 6.5M CaCl 2, 1ml 3.5m NaHCO 3, 25ml 20x 60mg/ml पेनिसिलिन, 100mg / EM और 10ml मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन सेंटock बाद प्रत्यारोपण के लिए तैयारी में). 28.5 डिग्री सेल्सियस और unfertilized अंडे या भ्रूण की मौत के लिए मॉनिटर पर भ्रूण सेते हैं.
भाग 2: गेसट्रुला स्टेज प्रत्यारोपण
2.1 Dechorionating और प्रत्यारोपण प्लेट तैयार
- प्लेटों Dechorionating Dechorionated भ्रूण कि पूरा नहीं किया है epiboly एक नरम नीचे की थाली के रूप में नहीं उनके जर्दी पालन और plastic.The दिन प्रत्यारोपण के लिए पहले आंसू, 1.5% agarose पहले से वर्णित समाधान का उपयोग करने की आवश्यकता है ., 5 गिरने से dechorionating प्लेटें -10 एक 100mm पेट्री डिश में पिघला हुआ agarose एमएल. केवल agarose की एक पतली परत (2-3mm) dechorination दौरान भ्रूण तकिया की जरूरत है. शांत करते हैं.
- प्रत्यारोपण अलग कुओं के साथ प्लेटें विशेषज्ञता प्लेटें 4 में वर्णित के रूप में किए जाने की जरूरत है. एक 100mm पेट्री डिश में 1.5% agarose समाधान के 30ml डालो और एक प्रत्यारोपण अच्छी तरह से ढालना सम्मिलित हैं. मोल्ड तीन 90 डिग्री पक्षों के शामिल 104 त्रिकोणीय प्रत्येक divots और एक 45 डिग्री angled पक्ष को शामिल करना चाहिए. कुओं के लिए दो पक्ष द्वारा साइड (छवि 1A, बैंगनी बॉक्स) भ्रूण पकड़ के लिए डिजाइन किए हैं. मोल्ड के तहत हवाई बुलबुले नहीं जाल ख्याल रखना. Agarose कठोर चलो. मोल्ड हटाना एक धँसा एक sloped बढ़त के साथ वर्ग कुओं वाले क्षेत्र से पता चलता है.
2.2 भ्रूण प्रत्यारोपण और उपकरण सेटअप
- दाता और मेजबान भ्रूण के पोजिशनिंग
- मेजबान और दाताओं का विकास करने के लिए उम्र से मिलान pairings के पास बनाए रखने के लिए नजर रखी जा जरूरत है. ऐसा करने के लिए, भ्रूण अलग तापमान (25-31 डिग्री सेल्सियस) पर उठाया जा धीमा या विकास क्रमशः गति कर सकते हैं.
- दोनों मेजबान और दाता भ्रूण एक dechorionating अगर लेपित थाली 1 घंटे गेसट्रुला चरण प्रत्यारोपण इस 5hpf तक पूरा होने की आवश्यकता होगी के मामले में वांछित उम्र से पहले पर dechorionated हाथ होना चाहिए.
- चरण 5.5hpf मेजबान और दाता भ्रूण में, ढाल पिछले एक प्रत्यारोपण एंटीबायोटिक EM से भरी थाली में लोड कर रहे हैं. भ्रूण व्यक्ति 1-मिमी एक गिलास पिपेट का उपयोग कुओं में लोड कर रहे हैं. एक उदाहरण के रूप में इस प्रकार है: पहली पंक्ति दाता भ्रूण के साथ भरा है (18 कुल अच्छी तरह से प्रति दो भ्रूण) और निम्न दो पंक्तियों मेजबान भ्रूण के साथ भर रहे हैं (अच्छी तरह से एक भ्रूण के प्रति, प्रति पंक्ति 9 भ्रूण).
- प्रत्यारोपण तंत्र की स्थापना
- प्रत्यारोपण Zeiss Lumar फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप है कि पूरी तरह से स्वचालित, जोस्टिक नियंत्रित ज़ूम और ध्यान हेरफेर है पर आयोजित की जाती हैं. जबकि प्रत्यारोपण माइक्रोस्कोप के इस स्वचालन के बिना किया जा सकता है है यह नाटकीय रूप से आसानी और दक्षता खासकर जब प्रत्यारोपण के एक उच्च संख्या में वांछित है में वृद्धि करता है.
- इसके पैमाने के बीच स्थान Eppendorf AirTram सेट. केशिका धारक को AirTram टयूबिंग (छवि 1 ए, लाल बॉक्स), कनेक्ट और Eppendorf स्वचालित micromanipulator (छवि 1A) धारक सुरक्षित. यह micromanipulator पूरी तरह से स्वचालित है और जोस्टिक नियंत्रित. फिर, यह स्वचालन पूरी तरह से आवश्यक है, लेकिन नहीं है काफी लोगों को आसपास और भ्रूण में सुई नेविगेट करने की क्षमता में सुधार. तथापि, हम AirTram के साथ कोई कठिनाइयों पड़ा है, वैकल्पिक रूप से, कई शोधकर्ताओं OilTram है कि सेल संग्रह के चिकनी नियंत्रण की पेशकश कहा जाता है पसंद करते हैं.
- capillaries प्रयोग किया जाता बाँझ Eppendorf TransferTips (ते) है कि एक 15 मीटर और टिप (छवि 1A हरे बॉक्स) से एक 20 डिग्री तुला के कोण 1mm टिप पर खोलने beveled थे .
2.3 गेसट्रुला स्टेज सेल प्रत्यारोपण
- 6hpf में, micromanipulator का उपयोग धीरे केशिका की नोक के साथ भ्रूण चरने के लिए सेल ऐसी है कि इसके midline और ढाल दिखाई और केशिका की नोक का विरोध कर रहे हैं extractions के लिए स्थिति में भ्रूण को बारी बारी से. केशिका में EM की एक छोटी राशि है करने के लिए हवा पानी इंटरफ़ेस है, जो कोशिकाओं को नुकसान होगा संपर्क कोशिकाओं के किसी भी मौका को रोकने Aspirate.
- Zebrafish भाग्य नक्शे पर आधारित है, अग्रमस्तिष्क के लिए कोशिकाओं को लक्षित बिल्कुल पशु पोल और 5 ढाल के बीच midline पर कोशिकाओं के प्रत्यारोपण की आवश्यकता है. पियर्स धीरे दाता भ्रूण के इस स्थान में बाह्य त्वक स्तर (rhodamine इंजेक्शन या GFP ट्रांसजेनिक भ्रूण). बाह्य त्वक स्तर और गेसट्रुला में अंतर्निहित जर्दी के बीच कोशिकाओं की मोटाई पतली है, इसलिए सावधानी का उपयोग करने के लिए जर्दी नहीं कोचना के रूप में यह अक्सर घंटे के भीतर मौत के लिए नेतृत्व करेंगे. AirTram aspirate कोशिकाओं धीरे का उपयोग केशिका में. हमेशा पानी की लाइन की दृश्यता को बनाए रखने. जबकि दाता में टिप का थोड़ा सा आंदोलन करने के लिए सेल सेल संपर्क ढीली मदद मिलेगी. दाता भ्रूण से 10-50 लगभग कोशिकाओं से पहले यह भ्रूण से निकाल दिया जाता है निकाला जाना चाहिए.
- दाता, वैसे ही उन्मुख मेजबान, और पियर्स से केशिका निकालें और सटीक सा में कोशिकाओं निष्कासितमुझे जानवर पोल और मेजबान भ्रूण की ढाल के बीच स्थान.
- प्रत्यारोपण के बाद, दाता और मेजबान भ्रूण कुओं से हटा रहे हैं, अलग और धीरे से एक लेपित अगर पेट्री एंटीबायोटिक EM के साथ भरा पकवान पर रखा. प्रत्यारोपण के कुओं में भ्रूण को छोड़कर मृत्यु दर बढ़ जाती है. पर सेते भ्रूण 28.5 डिग्री सेल्सियस
2.4 Visualizing और इमेजिंग भ्रूण
- निश्चित और जीने भ्रूण बढ़ते.
- होस्ट ट्रांसजेनिक GFP या rhodamine इंजेक्शन भ्रूण से निकाली गई भ्रूण कल्पना और imaged किया जा भ्रूण जिंदा या के रूप में तय कर सकते हैं. हम यहाँ दोनों तय की और रहते इमेजिंग विकल्पों के उदाहरण प्रस्तुत करते हैं. फिक्स भ्रूण 30hpf पर बलिदान थे 0.1M फॉस्फेट बफर (पंजाब) में 4% paraformadehyde 4 में 1 सी रात भर का उपयोग.
- भ्रूण 2x और तब 0.1M पंजाब में 3 एक्स 5 मिनट धो कुल्ला.
- उदाहरण के लिए हम प्रदान, फिक्स्ड मेजबान acetylated ट्यूबिलिन (α एटी) के रूप में 6 पहले से वर्णित के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ सभी axons के लिए immunolabeled थे.
- 75% ग्लिसरॉल में रखें भ्रूण, कमरे के तापमान पर सिंक और फिर 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस
- दो भ्रूण माउंट स्लाइड तैयार करें. बनाएँ दो पेट्रोलियम जेली वर्ग एक स्लाइड है कि अंदर और एक वर्ग coverslip के आकार व्यास मैच पर रूपरेखा.
- एक भ्रूण Deyolk और अग्रमस्तिष्क के एक ललाट देखने के लिए, बंद midbrain भर लंबरूप में काटने से अग्रमस्तिष्क काटना. ग्लिसरॉल का एक न्यूनतम राशि के साथ अच्छी तरह से पेट्रोलियम के भीतर इस ऊतक रखें. ओरिएंट उपयुक्त स्थिति में ऊतक और नमूना पर एक coverslip जगह.
- लाइव नमूना 0.75% agarose Tricaine के 4% समाधान (EM) में गिलास नीचे संस्कृति व्यंजन पर बने समाधान में घुड़सवार थे. Agarose solidifying से पहले भ्रूण इमेजिंग के लिए एक टंगस्टन सही ढंग से यह उन्मुख करने के लिए सुई के साथ छेड़छाड़ है. हमारे विश्लेषण के लिए हम coverslip खिलाफ उन्मुख अग्रमस्तिष्क सीधे.
- इमेजिंग
- दोनों तय की और जीने मेजबान Leica SP5 लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged थे. Z-ढेर अधिग्रहीत थे और 3 - या 4 - आयामी छवि प्रसंस्करण Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पूरा किया गया.
परिणाम:
अग्रमस्तिष्क में astroglial कोशिकाओं की भूमिका का पता करने के प्रयास में यह करने के लिए आवश्यक है करने के लिए दोनों इन कोशिकाओं diencephalic और telencephalic कोशिकाओं के छोटे समूहों के लिए और लक्ष्य अलग आनुवंशिक जोड़तोड़ कल्पना. Chimeric भ्रूण के इन प्रकार उत्पन्न करने के लिए, जिसमें भ्रूण के भीतर astroglial आबादी के कुछ हिस्से अलग जीनोटाइप या phenotype द्वारा, चाहे हम गेसट्रुला के उपयोग के साथ एक बहुमुखी दृष्टिकोण है कि GFP ट्रांसजेनिक भ्रूण, जो astroglia लेबल के उपयोग को जोड़ती है, का इस्तेमाल किया है कोशिका प्रत्यारोपण का मंचन किया. विशेष रूप से diencephalon करने के लिए हमारी क्लोन लक्ष्य, हम zebrafish गेसट्रुला भाग्य नक्शे का उपयोग करने के लिए चुनिंदा जानवर पोल और ढाल 5 (छवि 1B) से समदूरस्थ midline पर कोशिकाओं को निकालने . ये निकाले tg [gfap: GFP] कोशिकाओं तो एक जंगली प्रकार मेजबान गेसट्रुला, जो तब 30hpf उठाया गया था, और अग्रमस्तिष्क शरीर रचना के लिए संदर्भ स्थलों के रूप में सभी axons (α-acetylated ट्यूबिलिन) के लिए immunolabeled में एक ही स्थान में प्रत्यारोपित किया गया. एक उदाहरण के रूप में यहाँ दिखाया गया है, एक मेजबान भ्रूण के confocal इमेजिंग telencephalon और diencephalon (छवि 2A) भर में अलग GFP + कोशिकाओं का पता चलता है. इन GFP + कोशिकाओं का पूरा morphology इस clonal परख में मनाया जा सकता है, कि इन कोशिकाओं के अधिकांश विशेषता रेडियल glial आकारिकी, जहां सोम निलय क्षेत्र के निकट स्थित है और एक बड़े अंत पैर में एक रेडियल प्रक्रिया समाप्त पर ले खुलासा pial सतह (छवि 2A इनसेट). इन एकत्र ऑप्टिकल स्लाइस की Z-ढेर के तीन आयामी प्रतिपादन स्पष्ट रूप से लेबल axons (1 मूवी) करने के लिए सम्मान के साथ इन कोशिकाओं की स्थिति से पता चला है.
एक और सामान्यतः प्रतिरोपित कोशिकाओं को दृश्यमान करने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण के लिए शुरू में एक सेल की जर्दी में 594 Alexa जैसे एक फ्लोरोसेंट सेल वंश डाई, microinject जंगली प्रकार या GFP ट्रांसजेनिक भ्रूण का मंचन किया. एक उदाहरण के रूप में हम जंगली प्रकार भ्रूण में एक सेल चरण में 594 Alexa इंजेक्शन. हम उन्हें ढाल मंच गेसट्रुला विकसित करने के लिए अनुमति दी और फिर अग्रमस्तिष्क लक्षित प्रत्यारोपण किया जाता है इसके बाद के संस्करण के रूप में उल्लेख किया है, लेकिन बजाय हम में प्रत्यारोपित tg [gfap: nuc-Gfp] ट्रांसजेनिक मेजबान गेसट्रुला. लेजर स्कैन Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पृष्ठीय telencephalon की इमेजिंग GFP फ्लोरोसेंट लाल दाता कोशिकाओं के समूहों के बीच + अग्रमस्तिष्क (छवि 2B) के भीतर नाभिक का पता चला. हम आगे Confocal लेजर स्कैनिंग के साथ दो घंटे के कोर्स पर Z-ढेर हर तीन मिनट में इकट्ठा करके इस मेजबान का विश्लेषण किया. इस timelapse का प्रतिपादन 4 आयामी Volocity सॉफ्टवेयर (कामचलाऊ व्यवस्था) का उपयोग rhodamine कोशिका झिल्ली के गतिशील सेलुलर आंदोलनों से पता चलता है एकएन डी + GFP नाभिक (2 मूवी).
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चित्रा 1: प्रत्यारोपण और प्रयोगात्मक विधियों के तंत्र योजनाबद्ध. ए) उपकरण गेसट्रुला मंच प्रत्यारोपण आचरण किया है. Zeiss Lumar फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप इन प्रत्यारोपण का आचरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह जोस्टिक नियंत्रित फोकस और जूम (बाएं लाल वृत्त) है. Transferman एन.के. केशिका जो भी जोस्टिक नियंत्रित लाल वृत्त (दाएं) की स्थिति में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. सेटअप के दौरान 60-80 भ्रूण व्यक्ति अगर पहले एक प्लास्टिक मोल्ड (बैंगनी उल्लिखित बॉक्स) के साथ एक 100mm पेट्री डिश में बने कुओं में रखा जाता है. केश प्रत्यारोपण (TransferTip) Eppendorf द्वारा निर्मित एक 15μm भीतरी व्यास खोलने और एक 20 डिग्री angled टिप (हरी उल्लिखित बॉक्स) है. कक्षों की आकांक्षा Eppendorf AirTram (लाल उल्लिखित बॉक्स) के साथ नियंत्रित किया जाता है . बी) मेजबान भ्रूण में दाता से गेसट्रुला चरण प्रत्यारोपण प्रक्रिया के चित्रण. (यहाँ दिखाया गया है) भ्रूण या कक्ष: tg [GFP] gfap Alexa 594 (प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में) इंजेक्शन दाता भ्रूण से निकाले जाते हैं. कक्ष ढाल और जानवर पोल के बीच आधे रास्ते midline से हटा रहे हैं, और मेजबान भ्रूण के एक ही क्षेत्र में प्रत्यारोपित. होस्ट तय कर रहे हैं का उपयोग कर लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग imaged.
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चित्रा 2. गेसट्रुला zebrafish अग्रमस्तिष्क के भीतर चरण प्रत्यारोपण का उदाहरण ए) प्रतिरोपित tg [gfap: GFP] के साथ जंगली प्रकार मेजबान भ्रूण के एक ललाट दृश्य zebrafish अग्रमस्तिष्क और diencephalons telencephalon में कोशिकाओं. Axons लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं (α acetylated ट्यूबिलिन एंटीबॉडी) और प्रतिरोपित कोशिकाओं हरी (अंतर्जात GFP अभिव्यक्ति) में चिह्नित कर रहे हैं. भ्रूण 30 HPF कर रहे हैं. इनसेट से पता चलता है GFP + कोशिकाओं के रेडियल glial आकारिकी. प्रतिरोपित कोशिकाओं (लाल) fluorescing rhodamine के साथ मेजबान भ्रूण: बी) एक जीवित tg [nuc GFP gfap] telencephalon के पृष्ठीय दृश्य. मेजबान भ्रूण के नाभिक हरी (GFP) में चिह्नित कर रहे हैं. डैश्ड रेखा अग्रमस्तिष्क के पूर्वकाल सतह की रूपरेखा. ठोस लाइन निलय क्षेत्र को इंगित करता है. स्केल बार 10μm है.
1 मूवी. ectopically लेबल अग्रमस्तिष्क commissures के बीच रेडियल glial कोशिकाओं के संबंध गेसट्रुला से कक्ष का मंचन tg [gfap: GFP] भ्रूण एक गैर - GFP ट्रांसजेनिक जंगली प्रकार लाइन में प्रत्यारोपित किया गया . एक लेजर स्कैन Confocal Z-ढेर एकत्र किया गया था और तब 3 - डी Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिपादन के लिए संसाधित. प्रारंभ में, छवि 30hpf पर zebrafish अग्रमस्तिष्क के एक ललाट दृश्य है, और यह क्षैतिज रूप से फ़्लिप के रूप में 2B चित्रा की तुलना में. पूर्वकाल (एसी, शीर्ष) commissure और बाद ऑप्टिक commissure (POC, नीचे) के भीतर axons (एक - acetylated ट्यूबिलिन, लाल) में देखा जाता है. हरी कोशिकाओं GFP + प्रतिरोपित कोशिकाओं है कि अग्रमस्तिष्क और उत्पन्न स्पष्ट रेडियल glial आकारिकी में जड़ जमा ली हैं. के रूप में फिल्म की प्रगति दो रेडियल glial अंत शुल्क कोशिकाओं है कि POC संपर्क रखने पर केंद्रित है. 1 मूवी डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
2 मूवी. अग्रमस्तिष्क में प्रतिरोपित Alexa 594 लेबल कक्ष के timelapse इमेजिंग पहले Alexa 594 इंजेक्शन के साथ गेसट्रुला से कक्ष tg में प्रत्यारोपित किया गया. [Gfap: nuc GFP] ट्रांसजेनिक भ्रूण. यह फिल्म एक 2 timeseries, जिसमें Z ढेर हर 5 मिनट में ले जाया गया 3 - डी के एक प्रक्षेपण का प्रतिनिधित्व करता है. Z-ढेर एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर पर एकत्र किए गए थे, और 4 - डी renderings Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर पूरा किया. प्रतिरोपित कोशिकाओं Alexa 594 (लाल) के साथ लेबल रहे हैं, और GFP + नाभिक हरा कर रहे हैं. इस timelapse के रूप में चलाता है, 4D छवि 30hpf में अग्रमस्तिष्क की एक पृष्ठीय दृश्य के साथ शुरू होता है और X-अक्ष के बारे में घुमाने के लिए, के रूप में स्पष्ट आंदोलन सभी प्रतिरोपित कोशिकाओं के कोशिका झिल्ली में और GFP में पता चला है + नाभिक के रूप में अच्छी तरह से यहाँ क्लिक करें मूवी डाउनलोड 2.
Discussion
Chimeric भ्रूण उत्पन्न एक शक्तिशाली उपकरण है कि कई मॉडल प्रणाली, अर्थात् फल मक्खी (D.melanogaster), कीड़ा (C.elegans), (D.rerio) zebrafish और माउस (M.musculus) के भीतर कई शोध सवालों के पते है. हम तर्क है कि zebrafish मॉडल प्रणाली विशिष्ट एक अपेक्षाकृत आसान है, तेजी से और बहुमुखी रास्ते में chimeras पैदा करने के लिए अनुकूल है. zebrafish एक हड्डीवाला कि यह काफी अधिक सुलभ के रूप में माउस मॉडल की तुलना में माँ बनाने के बाहर विकसित है. Zebrafish भी कर रहे हैं काफी मक्खियों या कीड़े, जो कोशिका प्रत्यारोपण जैसे embryological जोड़तोड़ सरल से भी बड़ा है. इसके अलावा, कोशिका प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं ट्रांसजेनिक तकनीक के साथ गठबंधन की क्षमता संभव प्रयोगों में जो जीन समारोह स्थानीयकृत ऊतक विशिष्ट तरीके में हेरफेर किया जा सकता का एक बड़ा सरणी के लिए सक्षम बनाता है. उदाहरण के लिए, + GFP या rhodamine लेबल कोशिकाओं के छोटे क्लोन पूर्ण सेल morphologies है कि अक्सर एक homozygous ट्रांसजेनिक दाता में खो रहे हैं या आम एंटीबॉडी के साथ अंतर subcellular लेबलिंग की वजह से कल्पना असंभव हैं के लक्षण वर्णन सक्षम. इसके अलावा, transgenically टैग या fluorescently भरा कोशिकाओं का उपयोग करके, हम समय के साथ रहते zebrafish भ्रूण में दाता कोशिकाओं को ट्रैक कर सकते हैं. व्यक्ति की कोशिकाओं के timelapse इमेजिंग पूरे जीव के संदर्भ में सेलुलर व्यवहार के विश्लेषण प्रदान करता है एक उपन्यास.
हमारी प्रयोगशाला भी जोड़ती गर्मी झटका का उपयोग ऐसी है कि कुछ अक्षतंतु मार्गदर्शन cues ऊष्मायन तापमान में ऊंचाई (दिखाने के लिए नहीं डेटा) के बाद दाता कोशिकाओं में misexpressed किया जा सकता है है सेल प्रत्यारोपण के साथ ट्रांसजेनिक लाइनों inducible. इस तकनीक को एक अत्यंत शक्तिशाली और प्रत्यक्ष दृष्टिकोण के लिए स्थानीय एक स्थानिक और लौकिक विशिष्ट तरीके से है, जो हमें देखने के लिए कैसे विशिष्ट प्रोटीन विकास को प्रभावित करता है की अनुमति देता है में ब्याज की एक प्रोटीन misexpress है. हमारे मामले में, इस तकनीक commissures और midline 5 में glial कोशिकाओं की स्थिति में भट्ठा रोबो मार्गदर्शन cues के समारोह के पीछे हमारे ज्ञान का विस्तार कर सकते हैं.
फोकल यूवी uncaging और स्थानीयकृत heatshock उपकरण (लेजर या टांका लगाने का यंत्र) जैसे स्थानीय रूप से misexpressing जीनों के लिए अन्य तरीकों, 7-9 कोशिकाओं के एक छोटे समूह में जीन और मार्करों की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए वैकल्पिक तरीके की पेशकश करते हैं , तथापि, सेल प्रत्यारोपण स्थापित विश्लेषण के अंतिम वातावरण है कि किसी भी यूवी लेजर, या गर्मी कोशिका प्रत्यारोपण एक और अधिक नियंत्रित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण बनाने द्वारा प्रेरित आघात के मुक्त है. अंत में, हम कोशिका प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं हमारे neurodevelopmental जीव विज्ञान अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा हो पाया है. विभिन्न गुणों के साथ कोशिकाओं के क्लोन उत्पन्न सेल व्यवहार, जीन समारोह, सेल और स्वायत्तता के मौलिक सवालों को संबोधित में विकास जीवविज्ञानी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है.
Acknowledgments
हम उनके समर्थन और इस पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए Barresi लैब के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम अपने निरंतर तकनीकी सहायता के लिए अलेक्जेंडर कर्मकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जानवरों की देखभाल स्टाफ स्मिथ कॉलेज Zebrafish कॉलोनी को बनाए रखने में उनकी मदद के लिए धन्यवाद. हम भी इस प्रोटोकॉल की filmin के लिए कुछ माइक्रोस्कोपी उपकरण उधार करने के लिए माइक Hallacy, रूडी Rottenfusser, और कार्ल Zeiss MicroImaging धन्यवाद. यह काम एक NSF वित्त पोषित अनुसंधान अनुदान, 0615594 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Petri dishes | Tool | Fisher Scientific | 08-757-13 | 100 x 15 mm |
| Glass bottom culture plates | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-2.0-C | 35 x 15mm, No 1.5, Uncoated, Gamma-irradiated |
| Wide Bore Glass Pasteur pipets | Tool | Fisher Scientific | 63A-53-WT | |
| Glass filament capillaries for trough molds (without filament) and injection needles (with filament) | Tool | World Precision Instruments, Inc. | 1B150F-4 | 4 in. (100 mm), 1.5 / 0.84 OD/ID (mm) |
| Transplant Capillaries (TransferTip) | Tool | Eppendorf | 83000122-8 | Type IV, sterile, Int. 15μm; 20 degree bend |
| Transplant mold | Tool | Adaptive Science Tools | PT-1 | 150 triangular divots to hold individual embryos |
| Agarose, Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | A6013-250G | 1.5% agarose made in EM |
| (Antibiotic) Embryo Medium | Reagent | See Westerfield, 2007 | ||
| Phosphate Buffer | Reagent | See Westerfield, 2007 | ||
| Watchman Forceps | Tool | Fine Science Tools | 100+mm tip (dull), 50mm tip | |
| Rhodamine B Dextran | Lineage tracer dye | Molecular Probes, Life Technologies | D1824 | MW 10,000 Da, lysine-fixable, red (590nm) fluorescent dye excited with green (570nm) light |
| Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | SZX7 | |
| Fluorescent Stereo Microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Lumar | Fully Automated Joystick Controlled (Sycop) |
| Transplant Apparatus | Tool | Eppendorf | AirTram | |
| Automated Micromanipulator | Tool | Eppendorf | TransferMan NK2 | Joystick Controlled |
| Micromanipulator | Tool | Applied Scientific Instrumentation | 00-42-101-0000 | MM33 Right |
| Microinjector with Back Pressure Unit | Tool | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-2 BPU | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | Program: Heat 550; Velocity 200; Time/Delay 200; Pull force 120. |
References
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio. The Zebrafish Book. , 5th ed, University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2007).
- Zebrafish A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. ed , Oxford University Press. (2002).
- Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. Zebrafish, a practical approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. ed 1, Oxford University Press. 121-121 (2002).
- Woo, K., Shih, J., Fraser, S. E. Fate maps of the zebrafish embryo. Curr Opin Genet Dev. 5 (4), 439-439 (1995).
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- Halloran, M. C., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), 1953-1953 (2000).
- Hardy, M. E., Ross, L. V., Chien, C. B. Focal gene misexpression in zebrafish embryos induced by local heat shock using a modified soldering iron. Dev Dyn. 236 (11), 3071-3071 (2007).
