Summary
Technique requise pour visualiser le cœur battant dans la larve et l'adulte
Abstract
L'
Protocol
Avant de commencer
Coeurs adultes
- Fraîchement préparer hémolymphe artificielle (AH) solution contenant 108mm Na +, 5 mM de K +, 2 mM de Ca 2 +, 8mm MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, saccharose 10 mM, tréhalose 5mM, HEPES 5mm (pH 7,1, tous les réactifs de Sigma Chemicals). Le saccharose et le tréhalose devrait être ajouté à l'AH à partir de solutions mères réfrigéré juste avant l'utilisation afin de prévenir la contamination bactérienne.
- Apportez AH à la température ambiante et oxygéner la solution par air-bullage pendant au moins 15 min.
- Tirez plusieurs fins capillaires (par exemple capillaires de verre, 100 ul, VWR) requis pour l'élimination des graisses.
Cœur des larves
- Sylgard enduit de lamelles: en utilisant un cure-dent, le transfert d'environ 50-70μl de solution Sylgard sur une lamelle 22x22mm. Laissez durcir le Sylgard à 65 ° C pendant la nuit.
- Préparer le Broadie et le tampon de Bate (135mm NaCl, KCl 5 mM, MgCl 2 4 mM, 2 mM CaCl 2, 5 mM TES, saccharose 36mm;. PH 7,15 Voir Broadie et Bate, 1993).
- Préparer les outils nécessaires pour appliquer la colle Histoacryl. Tout d'abord, tirez plusieurs fins capillaires (par exemple sciences Produits GB100T8P). Connecter une extrémité de la pipette 1,5 ml avec un tuyau en plastique de petite taille (Tygon, 1 / 32 ") en insérant l'extrémité la plus petite dans le tube. Insérez un capillaire avec sa large ouverture à l'autre extrémité. Chargez le capillaire avec de la colle Histoacryl en plongeant le capillaire dans une goutte de colle et une aspiration douce dans l'embout en plastique. Lorsque vous travaillez avec de la colle on devrait avoir un deuxième verre capillaire à la main pour enlever la colle excessive de la pointe de la colle capillaire. La colle est liquide jusqu'à ce qu'il entre en contact avec une solution saline tamponnée où il va durcir en quelques secondes. Cependant, il reste généralement en plastique assez longtemps pour être retiré de la pointe de la colle capillaire ou à tout en l'appliquant à l'échantillon.
Semi-Cœur intacte drosophile de la mouche adulte
- Adulte mouches drosophiles sont anesthésiés avec Nap Fly (Caroline biologique Supply Co.) pendant 2-5 minutes. Des précautions doivent être prises pour ne pas laisser les mouches dans le Nap Fly pour de plus longues expositions. L'exposition à court terme au froid peut également être utilisé pour anesthésier les mouches mais le CO 2 n'est pas recommandée car elle a des effets plus durables sur le rythme cardiaque et de la rythmicité.
- Mouches anesthésiés sont placés, face dorsale vers le bas, dans une boîte de Petri recouverte d'une fine couche de gelée de pétrole. La cuticule hydrophobe dans les ailes et le corps de manière réversible «coller» à la gelée, mais la mouche peut être repositionné si nécessaire. Cela devient particulièrement important lors des manipulations ultérieures.
- Une première coupe est faite en utilisant une paire de ciseaux courbes printemps (Roboz # 5611). Les lames des ciseaux sont placés sous les pattes et inclinées vers le bas vers la surface dorsale du thorax près du cou. La tête, le cordon nerveux ventral, et les jambes sont enlevés avec une seule coupe. La préparation est ensuite immergé dans une oxygénée, hémolymphe artificielle (AH) solution.
- Avec des ciseaux à ressort de la pointe postérieure de l'abdomen (composé de segments abdominaux 7 et 8) est enlevé avec une seule coupe. Cela fournit un accès pour faire des coupes latérales le long des deux bords de l'abdomen et sert à couper les liens entre l'intestin postérieur et la cuticule abdominale. Le volet libéré de la cuticule abdominale ventrale est ensuite retiré.
- Dans les étapes 3 et 4, les liaisons antérieures et postérieures de l'intestin sont coupés de sorte les organes abdominaux sont désormais tenus en place que par tracheols. L'intestin et d'autres organes abdominaux peuvent habituellement être enlevé comme une masse unique à l'aide des pinces de bijoutier (Roboz, # 55) et doux tiraillement. Retrait des organes internes révèle le tube coeur battant encore attaché à la cuticule dorsale entourée de corps gras.
- Les corps gras sont assez opaques au microscope optique, par conséquent, il est souvent nécessaire d'enlever une partie de cette graisse, afin de voir le tube cardiaque clairement. Ceci est accompli en utilisant une technique de liposuccion finement dessinés capillaires en verre. Les capillaires sont faites en utilisant une norme pipette extracteur (Ex. Sutter P-97 Extracteur pipette) et sont ensuite insérées dans un tube en plastique (Tygon, 1 / 16 ") attaché à une source de vide. Ce système est utilisé à l'aspiration hors excès de graisse autour du tube cardiaque. Force d'aspiration est proportionnelle au diamètre pointe afin Pipettes avec pointes de plus de 40 microns de diamètre ne doit pas être utilisé. Un soin extrême doit être pris pour éviter de toucher le cœur lui-même et parce que la partie postérieure du cœur est très fragile de cette région devrait être évitée.
- Le tube cardiaque adulte drosophile est maintenant exposée et devrait être battu. Si nécessaire, le coeur cuticule et attachés peuvent être repositionnées en soulevant doucement la cuticule de la gelée de pétrole et soigneusement bourrage vers le bas, encore une fois en évitant tout contact avec le tissu cardiaque. A tson point la solution de bain de la préparation doit être remplacé par AHL frais. Cette préparation devrait être autorisé à s'équilibrer pendant 20-30 minutes avec l'oxygénation avant toute manipulation. Si la préparation doit être maintenu pendant plus de 60 minutes, il devrait être perfusé avec AHL frais.
Immobilisation larves de drosophile pour l'enregistrement optique
- Déposer une goutte de colle Histoacryl près de chaque coin du Sylgard lamelles. Ajouter 50 pl de B & B tampon pour les gouttes de colle qui durcit instantanément. Remplir l'espace entre les taches collées avec B & B - la colle va garder le tampon sur la diapositive.
- Prenez une larve L3 errance et le placer sur un morceau de papier tissu humide sur la glace pendant 2 min. Cela va ralentir son mouvement. Puis transfert de la larve dans le tampon et l'orienter à la face dorsale vers le haut (c'est le côté de la larve qui n'a pas la ceinture de denticules). Appliquez rapidement un peu de colle entre la région de la tête et le Sylgard. La colle durcit très rapidement et d'empêcher la tête de la larve de se déplacer.
- En utilisant des pinces attentivement attraper l'animal par les stigmates postérieurs et doucement l'étirer. Fixer la larve dans cette position par l'application de la colle le long des deux côtés de la larve à la moitié postérieure. Afin de réduire poursuite du mouvement de la cuticule par des muscles de la paroi du corps, ajouter plus de colle sur les flancs de l'animal. La larve est maintenant fixé dans cette position. La lamelle peut être placé dans une petite boîte de Petri remplie de AHL ou PBS. Battements du cœur peuvent désormais être enregistrées sans interférence de mouvements paroi du corps.
Les résultats représentatifs:
Le semi-intactes pour adultes Drosophila coeur battra rythmiquement pendant des heures suivantes de dissection lors maintenu en eau douce, AH oxygénée (voir données supplémentaires, Ocorr, et al., 2007). Un exemple représentatif est montré dans le film 1. Coeurs de 3 ème stade larvaire et les mouches jeunes (1 - 3 semaines après l'éclosion) présentent généralement un rythme cardiaque régulier à des taux entre 1 - 3 Hz. Les mouches plus de 3 semaines sont généralement plus arythmique, néanmoins, ces coeurs sont encore en mesure de battre spontanément pendant des heures dans l'AHL oxygénée. Coeurs perdus en mouches adultes qui sont endommagés à la suite de la procédure de dissection montrent typiquement des régions localisées de la constriction extrêmes qui sont incapables de se détendre. Heartbeat taux inférieure à 1 Hz sont rarement observés chez les mouches plus jeunes que 3 semaines d'âge, par conséquent de telles préparations sont considérés comme étant endommagés et sont éliminés.
Cliquez ici pour télécharger la vidéo 1. - Une volée un semaine anciennes de type sauvage adulte (souche de laboratoire w 1118) montrant le tube cardiaque exposés abdominale (antérieure à la gauche). Remarque réguliers, des contractions rythmiques. Zones opaques dans le coin supérieur droit sont les autres corps gras abdominaux; cellules rondes de chaque côté du cœur sont les cellules péricardiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le modèle de drosophile s'est avérée être un puissant outil génétique qui a été utilisée pour traiter une variété de questions scientifiques allant du développement embryologique de l'apprentissage et la mémoire. Récemment cet organisme modèle polyvalent a été utilisé pour étudier la génétique de la fonction cardiaque chez la mouche. Un certain nombre de tentatives pour quantifier la physiologie cardiaque chez les adultes de drosophile sont appuyés sur les observations faites chez des mouches intacte à travers la cuticule abdominale. La plupart de ces approches se sont appuyés sur l'observation visuelle ou des enregistrements de changements dans l'émetteur intensité de la lumière à travers l'abdomen de quantifier un seul paramètre, la fréquence cardiaque. Ces méthodes ont plusieurs limites: en général seulement l'extrémité antérieure du cœur peut être observée, ce qui est observé est le mouvement des corps gras secondaire à la contraction cardiaque, et l'influx nerveux vers le cœur est intact. L'adulte de semi-intactes préparation fournit une vue plus détaillée d'une grande partie de la quantification cardiaque fonctionnement permettant un certain nombre de paramètres en plus du rythme cardiaque. Il peut être utilisé pour électrophysiologiques ou optiques (voir article Jove, 1435) les procédures d'enregistrement. En outre, cette préparation est adaptée pour des manipulations histologiques (voir article Jove, 1435). Il peut également être extrait comme un échantillon de tissu cardiaque relativement propre pour la PCR, Western blot, l'analyse par microréseau, etc
Le cœur adulte chez la drosophile est, pour les fins de cette dissection, idéalement fixé à la cuticule dorsale de l'abdomen par un réseau de muscles alaires. Ainsi il est possible de disséquer l'écart de la tête et corde nerveuse ventrale couché, puis de retirer les organes internes, sans endommager le cœur. Toutefois, un soin extrême devrait être prise à l'étape 3 ne couper que la pointe de l'abdomen comme le cœur s'étend dans segment abdominal 5 / 6 et une cellule de stimulateur ou de cellules est sans doute présente dans cette région.
Des précautions doivent également être prises pour éviter de toucher le cœur lors de la dissection. En cas de contact avec le cœur est soupçonné de la préparation doit être jeté. Aspiration modérée suffit généralement à éliminer une partie de la graisse et tracheols qui entourent le cœur pour une meilleure visualisation du tube cardiaque, mais une succion excessive peut également endommager le coeur. La force d'aspiration est contrôlé principalement par la taille de la pointe de la pipette utilisée pour la liposuccion; conseils supérieure à environ 40 microns doivent être évités.
Contrairement à l'adulte, le tube cardiaque chez la larve de drosophile sont relativement libres de se déplacer autour de la cavité du corps. Ainsi, une préparation semi-larvaires intacts coeur présente des difficultés pour les techniques d'enregistrement optique. En raison de la translucidité du tégument, il est possible de visualiser le cœur dans la larve intacte en utilisant la microscopie en fond clair. La technique décrite ici colle immobilise la larve d'un stade de développement et maintient le cœur dans une position fixe. Cela permet l'enregistrement d'un tube cardiaque relativement stationnaire. Contractions cardiaques enregistrées par la larve immobilisés peuvent être ensuite analysés par la technique d'enregistrement optique décrit dans JoVE 1435.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KO est soutenu par une subvention de l'American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
