Summary
Technik für die Visualisierung des schlagenden Herzens in Larven und erwachsene erforderlich
Abstract
Die
Protocol
Bevor Sie beginnen
Adult Herzen
- Frisch vorzubereiten künstliche Hämolymphe (AH) Lösung mit 108mm Na +, 5 mM K +, 2 mM Ca 2 +, 8mm MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, 10 mM Saccharose, 5 mM Trehalose, 5 mM HEPES (pH 7,1, alle Reagenzien von Sigma Chemicals). Die Saccharose und Trehalose sollte auf die AH aus dem Kühlschrank Stammlösungen hinzugefügt gerade vor Gebrauch, um bakterielle Verunreinigungen zu verhindern.
- Bringen AH auf Raumtemperatur und mit Sauerstoff die Lösung durch Luft-Blasen für mindestens 15 min.
- Ziehen Sie mehrere feine Kapillaren (z. B. Glaskapillaren, 100 ul, VWR) zur Entfernung von Fett benötigt.
Larven Herzen
- Sylgard-beschichtete Deckgläser: mit einem Zahnstocher, Transfer über 50-70μl der Sylgard Lösung auf eine 22x22mm Deckglas. Lassen Sie die Sylgard härten bei 65 ° C über Nacht.
- Bereiten Sie die Broadie und Bate-Puffer (135mm NaCl, 5 mM KCl, 4mm MgCl 2, 2 mM CaCl 2, 5 mM TES, 36mm Sucrose;. PH 7,15 Siehe Broadie und Bate, 1993).
- Bereiten Sie die notwendigen Tools, um die Histoacryl Klebstoff anwenden. Ziehen Sie zunächst mehrere feine Kapillaren (zB Science Products GB100T8P). Schließen Sie ein 1,5 ml Pipettenspitze mit einem kleinen Plastikschlauch (Tygon, 1 / 32 "), indem Sie das kleinere Ende in die Röhre. Legen Sie eine Kapillare mit der weiten Öffnung am anderen Ende. Laden Sie die Kapillare mit Histoacryl Kleber durch Eintauchen der Kapillare in einem Tropfen Klebstoff und sanfte Saugwirkung in die Spitze aus Kunststoff. Bei der Arbeit mit dem Klebstoff sollte man eine zweite Glaskapillare zur Hand haben, um übermäßige Kleber von der Spitze des Klebers Kapillare zu entfernen. Der Kleber ist flüssig, bis es in Kontakt mit Kochsalzlösung, wo es härtet innerhalb von ein paar Sekunden. Aber es bleibt in der Regel aus Kunststoff lange genug, um aus dem Leim Kapillarspitze oder während ihrer Anwendung auf die Probe entfernt werden.
Semi-intakt Drosophila Herz aus dem Adult Fly
- Adult Drosophila-Fliegen werden anästhesiert mit Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) für 2-5 Minuten. Vorsicht ist geboten, um die Fliegen in der Fly Nap für längere Belichtungszeiten zu verlassen. Kurzfristige Exposition gegenüber Kälte kann auch verwendet werden, um Fliegen zu betäuben, aber CO 2 wird nicht empfohlen, da es länger hat nachhaltige Auswirkungen auf die Herzfrequenz und Rhythmik.
- Narkotisierten fliegt platziert sind, dorsalen Seite nach unten in eine Petrischale mit einer dünnen Schicht Vaseline beschichtet. Die hydrophoben Cuticula in den Flügeln und Körper reversibel "kleben" an das Gelee, aber die fliegen können neu positioniert, wenn nötig. Dies wird besonders wichtig bei der späteren Manipulationen.
- Eine erste Schnitt erfolgt mit einer gebogenen Feder Schere (Roboz # 5611). Die Scherenblätter sind unter die Beine gelegt und nach unten in Richtung der dorsalen Fläche des Brustkorbes in der Nähe des Halses abgewinkelt. Der Kopf, Bauchmark und Beine sind mit einem einzigen Schnitt entfernt. Das Präparat wird dann in ein mit Sauerstoff angereichertes, künstliche Hämolymphe (AH)-Lösung getaucht.
- Mit Feder Schere der hinteren Spitze des Bauches (bestehend aus Abdominalsegmente 7 und 8) ist mit einem einzigen Schnitt entfernt. Dies ermöglicht den Zugang zur Herstellung von seitlichen Einschnitte an den beiden Rändern des Bauches und dient dazu, die Verbindung zwischen dem hinteren Bauch und der Bauch Nagelhaut zu durchtrennen. Die befreiten Klappe ventral abdominal Nagelhaut wird dann entfernt.
- In den Schritten 3 und 4 des vorderen und hinteren Anschlüsse des Darms werden durchtrennt, so dass die Bauchorgane sind jetzt an Stelle nur durch tracheols statt. Der Darm und andere Bauchorgane können in der Regel als eine einzige Masse mit Juwelier Zange (Roboz, # 55) und sanft zerren entfernt werden. Das Entfernen der inneren Organe zeigt das schlagende Herz Rohr noch an der dorsalen Kutikula durch Fettkörper umgeben befestigt.
- Die Fettkörper sind ziemlich undurchsichtig im Lichtmikroskop folglich ist es oft notwendig, um etwas von diesem Fett zu entfernen, um das Herz Rohr deutlich zu sehen. Dies wird durch eine Fettabsaugung Technik mit fein gezeichneten Glaskapillaren durchgeführt. Kapillaren werden mit einer Standard-Pipette Abzieher (zB Sutter P-97 Pipette Puller) und werden dann in Kunststoff-Schlauch (Tygon, 1 / 16 ") befestigt, um ein Vakuum Quelle eingefügt. Dieses System ist zur Absaugung von überschüssigem Fett um das Herz Rohr eingesetzt. Saugkraft ist proportional zur Spitze Durchmesser so Pipetten mit Spitzen von mehr als 40 Mikrometer im Durchmesser nicht verwendet werden sollte. Extreme Vorsicht ist zu vermeiden, berühren das Herz selbst und werden, weil der hintere Teil des Herzens ist sehr zerbrechlich dieser Region insgesamt sollte vermieden werden.
- Die erwachsenen Drosophila Herzen Röhre ist nun frei und sollte zu schlagen. Bei Bedarf kann die Nagelhaut und befestigt Herz kann durch leichtes Anheben der Oberhaut aus der Vaseline und sorgfältig Stopf es wieder nach unten, wieder jeglichen Kontakt mit dem Herzgewebe neu positioniert werden. Bei tseine Stelle die Lösung Baden der Zubereitung sollte mit frischem AHL ersetzt werden. Dieses Präparat sollte gestattet werden, für 20-30 Minuten mit Sauerstoffanreicherung vor Manipulationen Gleichgewicht sein. Wenn die Zubereitung nicht länger als 60 Minuten gehalten werden, sollte es mit frischen AHL perfundiert werden.
Immobilisierung Drosophila-Larven für die optische Aufzeichnung
- Geben Sie einen Tropfen Histoacryl Kleber in der Nähe von jeder Ecke des Sylgard Deckgläser. Add 50 ul B & B-Puffer auf den Leim Tropfen, die sich verhärten sofort. Füllen Sie den Raum zwischen den geklebten Stellen mit B & B - der Leim der Puffer auf der Folie halten.
- Nehmen Sie eine Wanderung L3 Larve und legen Sie es auf ein Stück nasse Seidenpapier auf Eis für 2 min. Dies verlangsamt die Bewegung. Übertragen Sie anschließend die Larve in den Puffer und richten Sie ihn mit dem Rücken nach oben (dies ist die Seite der Larve, die denticle Gürtel fehlt). Schnell mit Leim zwischen dem Kopfbereich und dem Sylgard. Der Kleber härtet sehr schnell und verhindern, dass der Kopf der Larve von bewegten.
- Mit einer Pinzette vorsichtig packen das Tier von der hinteren Luftlöcher und sanft dehnen. Fix die Larve in dieser Position durch die Anwendung des Klebers auf beiden Seiten der Larve an der hinteren Hälfte. Um eine weitere Bewegung der Kutikula durch die Wand des Körpers Muskeln zu verringern, fügen Sie mehr Leim an den Flanken des Tieres. Die Larve ist nun in dieser Position fixiert. Das Deckglas kann in eine kleine Petrischale mit AHL oder PBS gefüllt platziert werden. Herzschläge können nun ohne Einmischung von Körper Wand Bewegungen aufgezeichnet werden.
Repräsentative Ergebnisse:
Die semi-intakten, erwachsenen Drosophila Herz rhythmisch schlagen für Stunden nach Dissektion, wenn in frischen, sauerstoffreichen AH gepflegt (siehe Ergänzende Daten, Ocorr, et al., 2007). Ein repräsentatives Beispiel ist in Movie 1 dargestellt. Herz vom 3. Larvenstadium Larve und jungen Fliegen (1 bis 3 Wochen nach Schlüpfen) weisen in der Regel eine regelmäßige Herzschlag mit Raten zwischen 1 bis 3 Hz. Flies älter als 3 Wochen in der Regel mehr Arrhythmie, dennoch sind diese Herzen noch in der Lage, spontan zu schlagen über Stunden in Sauerstoff AHL. Hearts in erwachsenen Fliegen, die als Folge der Dissektion Verfahren beschädigt sind in der Regel zeigen lokalisierten Regionen extreme Verengung, die nicht in der Lage zu entspannen. Damit solche Präparate gelten als beschädigt werden und werden verworfen; Heartbeat Preise langsamer als 1 Hz sind nur selten in Fliegen jünger als 3 Wochen alt beobachtet.
Klicken Sie hier, um Movie 1 herunterladen. - A eine Woche alt erwachsenen Wildtyp fly (w 1118 Labor-Stamm), die den exponierten Bauch-Herz Rohr (anterior nach links). Beachten Sie regelmäßige, rhythmische Kontraktionen. Opaque Regionen in der oberen rechten Ecke werden die restlichen Bauchfett Stellen; runde Zellen auf beiden Seiten des Herzens sind pericardial Zellen.
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Discussion
Die Drosophila-Modell hat sich als ein leistungsfähiges Tool, das genetische verwendet wurde, um eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragestellungen reichen von embryonalen Entwicklung, Lernen und Gedächtnis-Adresse sein. Kürzlich dieses vielseitige Modell-Organismus wurde verwendet, um die Genetik der Herzfunktion in-the-fly zu untersuchen. Eine Reihe von Versuchen, Herz Physiologie bei erwachsenen Drosophila zu quantifizieren sind auf Beobachtungen in intakten fliegt durch die Bauchdecke Nagelhaut, gelten. Die meisten dieser Ansätze sind auf die visuelle Beobachtung oder Aufnahmen von Änderungen in der Lichtintensität Sender durch den Bauch verlassen, um einen einzigen Parameter, die Herzfrequenz zu quantifizieren. Diese Methoden haben mehrere Einschränkungen: in der Regel nur das vordere Ende des Herzens beobachtet werden kann, was beobachtet wird ist die Bewegung der Fettkörper zweitrangig gegenüber der Herzkontraktionen, und das Nervensystem Eingang in das Herz intakt ist. Die erwachsenen semi-intakten Präparat bietet eine detailliertere Ansicht eines großen Teils der Funktionsweise Herzen erlauben die Quantifizierung einer Vielzahl von Parametern zusätzlich zur Herzfrequenz. Es kann für elektrophysiologische oder optische verwendet werden (siehe JoVE Artikel, 1435) Aufzeichnung Verfahren. Darüber hinaus ist dieses Präparat geeignet für die histologische Manipulationen (siehe JoVE Artikel, 1435). Es kann auch als ein relativ reines Herz Gewebeprobe für die PCR entnommen werden, Western Blotting, Microarray-Analyse, etc.
Die erwachsenen Herzen in Drosophila ist, für die Zwecke dieser Sektion, bequem an der dorsalen Kutikula der Bauch durch ein Netzwerk von Alary Muskeln fixiert. So ist es möglich zu sezieren entfernt den Kopf und Bauch liegend Nervenstrang, und dann auf die inneren Organe ohne Beschädigung des Herzens zu entfernen. Allerdings sollte äußerste Sorgfalt in Schritt 3 getroffen werden, um nur die Spitze des Bauches geschnitten als das Herz bis in Abdominalsegment 5 / 6 und einem Herzschrittmacher Zelle oder Zellen ist ohne Zweifel in dieser Region.
Auch ist sorgfältig zu vermeiden, berühren das Herz während der Präparation werden. Wenn Kontakt mit dem Herz wird vermutet, die Vorbereitung muss verworfen werden. Moderate Sog der Regel genügt es, entfernen Sie einige der Fett-und tracheols, dass das Herz Surround für eine bessere Darstellung des Herzens Rohr aber übermäßige Absaugung kann auch zu Schäden am Herzen. Die Saugkraft ist in erster Linie durch die Größe der Pipettenspitze für die Fettabsaugung eingestellt werden können; Tipps größer als etwa 40 Mikrometer sollte vermieden werden.
Anders als in den Erwachsenen ist das Herz Rohr in Drosophila Larve relativ frei, um die Körperhöhle zu bewegen. So ein semi-intakten Larven Herzen der Zubereitung Schwierigkeiten für die optische Aufnahme-Techniken. Aufgrund der Lichtdurchlässigkeit der Haut ist es möglich, das Herz in die intakte Larve mit Hellfeldmikroskopie visualisieren. Der Kleber hier beschriebene Technik immobilisiert Larve jedem beliebigen Entwicklungsstadium und hält das Herz in einer festen Position. Dies ermöglicht die Aufnahme einer relativ stationären Herz Röhre. Herzkontraktionen durch solche immobilisierten Larve aufgenommen wurden, können anschließend von der optischen Aufnahme-Technik in JoVE 1435 beschrieben, analysiert werden.
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Acknowledgments
KO wird durch einen Zuschuss von der American Heart Association unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
