Summary
Teknik som krävs för att visualisera slående hjärta hos larver och vuxna
Abstract
Den
Protocol
Innan du börjar
Vuxen hjärtan
- Färskt förbereda konstgjorda hemolymph (AH) lösning innehållande 108mm Na +, 5mm K +, 2 mm Ca 2 +, 8mm MgCl 2, 1mm NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, 10mm sackaros, 5mm trehalos, 5mm HEPES pH 7,1 (alla reagenser från Sigma Chemicals). Den sackaros och trehalos bör läggas till AH från kylda stamlösningar strax före användning för att förhindra bakteriell kontamination.
- Ta AH till rumstemperatur och syresätta lösningen med flyg-bubbla i minst 15 min.
- Dra flera fina kapillärer (t.ex. glas kapillärerna, 100ul, VWR) som krävs för borttagning av fett.
Larver hjärtan
- Sylgard-belagd täckglas: med hjälp av en tandpetare, överföring om 50-70μl av Sylgard lösningen på en 22x22mm täckglas. Låt Sylgard hårdnar vid 65 ° C över natten.
- Förbered Broadie och Bate buffert (135mm NaCl, 5mm KCl, 4mm MgCl 2, 2mm CaCl 2, 5mm TES, 36mm sackaros;. PH 7,15 Se Broadie och Bate, 1993).
- Förbered de verktyg som krävs för att tillämpa histoacryl lim. Drag först flera fina kapillärer (t.ex. Science Produkter GB100T8P). Anslut en 1,5 ml pipettspets med en liten plastslang (Tygon, 1 / 32 ") genom att sätta den mindre änden i röret. Sätt i en kapillär med bred öppning till den andra änden. Ladda kapillär med Histoacryl lim genom att doppa kapillär till en droppe lim och mjukt suga in i plast spets. När du arbetar med lim man ska ha en andra glaset kapillär till hands för att ta bort alltför lim från spetsen av lim kapillär. Limmet är flytande tills den kommer i kontakt med koksaltlösning där den kommer att hårdna inom ett par sekunder. Det återstår dock vanligtvis plast tillräckligt länge för att tas bort från limmet kapillär spets eller att samtidigt tillämpa det på provet.
Semi-intakt bananfluga Hjärta från Vuxen Fly
- Vuxen Drosophila flugor bedövas med Fly Nap (Carolina Biological Supply Co) i 2-5 minuter. Man måste vara försiktig att inte lämna flugor i Fly Nap längre exponeringar. Korttidsboende exponering för kyla kan också användas för att söva flugor men CO 2 rekommenderas inte eftersom den har längre livslängd effekter på hjärtfrekvens och rhythmicity.
- Sövda flugor är placerade, ryggsidan ner i en petriskål belagd med ett tunt lager vaselin. Den hydrofoba nagelband i vingarna och kroppen reversibelt "fastnar" i gelé, men flyga kan flyttas om det behövs. Detta blir särskilt viktigt under efterföljande manipulationer.
- En första skär är tillverkad med hjälp av en böjd par av vårens sax (Roboz # 5611). Den sax Bladen är placerade under benen och vinklas ner mot dorsala ytan av bröstkorgen nära halsen. Huvudet, ventralt nerv sladd, och benen tas bort med ett enda snitt. Preparatet är sedan sänks ner i en syresatt, artificiella hemolymph (AH) lösning.
- Använda våren sax den bakre spetsen av buken (som består av buken segment 7 och 8) tas bort med ett enda snitt. Detta ger tillgång för att göra tvärgående snitt längs båda kanterna av buken och tjänar till att bryta sambandet mellan den bakre tarmen och i buken nagelband. Den befriade flik av ventrala buken nagelband tas sedan bort.
- I steg 3 och 4 främre och bakre anslutningar av tarmen är avskurna så att bukorganen nu hålls på plats endast av tracheols. Tarmen och andra bukorganen kan vanligtvis tas bort som en enda massa med juvelerare pincett (Roboz, # 55) och mild rycka. Ta bort de inre organen avslöjar bultande hjärta röret fortfarande sitter i rygg nagelbanden omgiven av fett organ.
- Fettet organ är helt ogenomskinliga i ljusmikroskop följaktligen är det ofta nödvändigt att ta bort en del av detta fett för att se hjärtat röret tydligt. Detta uppnås genom en fettsugning teknik med fint tecknade glas kapillärer. Kapillärer är gjorda med en vanlig pipett avdragare (T.ex. Sutter P-97 Pipettera Avdragare) och sedan in i plaströr (Tygon, 1 / 16 ") som bifogas ett vakuum källa. Detta system används för att sug bort överflödigt fett från hela hjärtat röret. Sug kraft är proportionell mot toppen diameter så pipetter med tips större än 40 mikrometer i diameter inte bör användas. Extrem försiktighet måste vidtas för att undvika att röra själva hjärtat och eftersom den bakre delen av hjärtat är mycket bräcklig denna region bör undvikas helt.
- Den vuxna Drosophila hjärtat röret är nu utsatta och bör slå. Om nödvändigt nagelband och bifogade hjärtat kan flyttas genom att försiktigt lyfta nagelband ur vaselin och packas noggrant tillbaka ner igen undvika kontakt med hjärtat. Vid thans poäng lösningen bad beredningen bör ersättas med nya AHL. Denna beredning bör få jämvikt i 20-30 minuter med syresättning innan någon manipulationer. Om beredningen skall kunna upprätthållas under längre tid än 60 minuter det borde vara perfusion med färsk AHL.
Immobilisera Drosophila larver för optisk inspelning
- Placera en droppe Histoacryl lim nära varje hörn av Sylgard täckglas. Tillsätt 50μl i B & B buffert för att limmet droppar som kommer att hårdna omedelbart. Fyll utrymmet mellan limmade fläckarna med B & B - limmet kommer att hålla bufferten på bilden.
- Ta en vandrande L3 larv och placera den på en bit vått papper på is i 2 min. Detta kommer att bromsa dess rörelse. Sedan överföra larven in i bufferten och rikta den med ryggsidan uppåt (detta är den sida av larven som saknar LITEN TAND bälten). Snabbt tillämpa lite lim mellan huvudet regionen och Sylgard. Limmet hårdnar snabbt och förhindra huvudet av larven från att flytta.
- Använd pincett försiktigt tag i animaliska bakre spiracles och försiktigt sträcka ut den. Fix larven i denna position genom att tillämpa det lim längs båda sidorna av larven i den bakre halvan. För att ytterligare minska flödet av nagelbanden av musklerna kroppen väggen, lägga mer lim på sidorna av djuret. Larven är nu fast i detta läge. Den täckglas kan placeras i en liten petriskål fylld med AHL eller PBS. Hjärtslag kan nu spelas in utan inblandning från kroppsrörelser väggen.
Representativa resultat:
Den semi-intakt vuxna Drosophila hjärtat slår rytmiskt i timmar efter dissektion när upprätthålls i färska, syresatt AH (se Kompletterande Data, Ocorr, et al., 2007). Ett representativt exempel visas i Movie 1. Hjärtan från 3: e INSTAR larv och unga flugor (1 - 3 veckor efter eclosion) uppvisar i allmänhet en vanlig hjärtslag med en hastighet mellan 1 - 3 Hz. Flugor äldre än 3 veckor i allmänhet är mer arytmier, men trots dessa hjärtan fortfarande kan slå spontant i timmar i syresatt AHL. Hjärtan i vuxna flugor som är skadade till följd av dissektion förfarandet visar vanligtvis lokaliserade områden av extrem sammandragning som inte kan slappna av. Heartbeat priserna långsammare än 1 Hz är sällan hos flugor yngre än 3 veckors ålder, alltså sådana preparat anses vara skadad och kasseras.
Klicka här för att ladda Film 1. - En en vecka gammal vuxen wildtype flyga (w 1118 laboratorie-stam) som visar exponerade buken hjärtat rör (anterior till vänster). Notera regelbundna, rytmiska sammandragningar. Ogenomskinlig regioner i övre högra hörnet är de återstående bukfett organ, runda celler på vardera sidan av hjärtat är perikardiell celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila modellen har visat sig vara ett kraftfullt genetiska verktyg som har använts för att ta itu med en rad olika vetenskapliga frågor sträcker sig från embryologiska utveckling till inlärning och minne. Nyligen denna mångsidiga modell organism har använts för att undersöka genetik av hjärtfunktionen i gylfen. Ett antal försök att kvantifiera hjärtat fysiologi hos vuxna Drosophila har förlitat sig på observationer gjorda i intakt flyger genom buken nagelbanden. De flesta av dessa metoder har förlitat sig på visuell observation eller inspelningar av förändringar i ljusintensitet sändare genom buken att kvantifiera en enda parameter, hjärtfrekvens. Dessa metoder har flera begränsningar: vanligen endast den främre änden av hjärtat kan observeras, vad som observeras är rörelsen av fett organ sekundärt till hjärtat sammandragningar och nervösa impulser till hjärtat är intakt. Den vuxna semi-intakt förberedelse ger en mer detaljerad bild av en stor del av hur hjärtat möjliggör kvantifiering av ett antal parametrar utöver hjärtfrekvensen. Det kan användas för elektrofysiologiska eller optiska (se JUPITER artikel, 1435) inspelning förfaranden. Dessutom är denna beredning lämplig för histologisk manipulationer (se JUPITER artikel, 1435). Den kan också hämtas som en relativt rent hjärta vävnadsprov för PCR, Western blotting, microarray analyser, etc.
Den vuxna hjärta i Drosophila är för tillämpningen av denna dissektion, bekvämt fast på rygg nagelbanden av buken genom ett nätverk av alary muskler. Det är alltså möjligt att dissekera bort huvudet och ventrala liggande nerv sladden, och sedan ta bort de inre organen utan att skada hjärtat. Dock bör man vara extremt noga i steg 3 för att klippa bara den yttersta spetsen av buken som hjärtat sträcker sig in i buken segmentet 5 / 6 och en pacemaker eller flera celler är utan tvekan finns i denna region.
Man måste också vidtas för att undvika att röra vid hjärtat under dissekering. Om kontakt med hjärtat misstänks beredningen kasseras. Måttlig sug räcker oftast att ta bort en del av fettet och tracheols som omger hjärtat för bättre visualisering av hjärtat röret utan alltför sug också kan skada hjärtat. Den sugkraft styrs främst av storleken på pipettspetsen används för fettsugning, tips större än ca 40 mikrometer bör undvikas.
Till skillnad från vuxna, är hjärtat röret i Drosophila larv relativt fria att röra sig i kroppen hålighet. Alltså en semi-intakt larver hjärtat beredningens svårigheter för optisk inspelningsteknik. På grund av genomskinlighet i integument är det möjligt att visualisera hjärtat i den intakta larven med brightfield mikroskopi. Limmet Tekniken beskrivs här immobilizes larv av någon utvecklingsstadiet och håller hjärtat i ett fast läge. Detta möjliggör inspelning av ett relativt stillastående hjärta rör. Heart sammandragningar registreras av sådan immobiliserade larven kan sedan analyseras av optiska inspelningsteknik beskrivs i JUPITER 1435.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KO stöds av ett bidrag från American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
