Summary
幼虫および成体での心臓の鼓動を可視化するために必要なテクニック
Abstract
市販
Protocol
あなたが始める前に
大人の心
- 新鮮な108mMのNa +、5mMのK +、2mMのCa 2 +は 、8MMのMgCl 2、1mMののNaH 2 PO 4、4mmの飽和NaHCO 3、10mMのスクロース、5mMのトレハロース、5mMのHEPES（pHは7.1、すべての試薬 からを含む人工体液（AH）溶液を調製シグマケミカル）。スクロースおよびトレハロースは、細菌汚染を防ぐために、使用直前に冷蔵保存溶液からAHに追加する必要があります。
- 室温および少なくとも15分間空気バブリングによって酸素を解決するためにAH持参。
- 脂肪の除去に必要ないくつかの細かい毛細血管（例えばガラス管、100ul、VWR）を引き出します。
幼虫の心
- Sylgardコーティングされたカバースリップ：22x22mmカバースリップの上に、Sylgard溶液を50 -70μl程度の転送を爪楊枝を使って。 ° C一晩65℃Sylgard硬化をしましょう。
- Broadieとベイトのバッファを準備します（135mm幅のNaCl、5mMのKClを、4mmののMgCl 2、2mMのCaCl 2で 、5mMのTES、36mmのショ糖、pHは7.15 Broadieとベイト、1993を参照してください。）。
- histoacryl接着剤を適用するために必要なツールを準備します。最初に、いくつかの細かい毛細血管（例えば、科学製品GB100T8P）引き出します。チューブに小さい方の端を挿入することにより、小さなプラスチック製のチューブ（タイゴン、1 / 32"）を1.5ミリリットルのピペットチップを接続する。もう一方の端に広い開口部とキャピラリを挿入します。プラスチック製の先端に接着剤と穏やかな吸引のドロップに毛細管を浸漬することによりHistoacryl接着剤でキャピラリーをロードする。接着剤を扱うとき一キャピラリー接着剤の先端から、過剰な接着剤を除去するために手でキャピラリー番目のグラスを持っている必要があります。それは数秒内にそうなる硬化緩衝生理食塩水と接触するまで、接着剤は液体です。しかし、それは通常、試料に印加しながら接着剤キャピラリー先端からまたはに削除されるのに十分な長さのプラスチックのままです。
アダルトフライから半無傷ショウジョウバエのハート
- 大人ショウジョウバエのハエは、2〜5分間フライナップ（キャロライナ生物サプライ株式会社）で麻酔する。ケアは、長い露光のためのフライナップでハエを状態にならないようにご注意ください。寒さへの短期暴露はまた、ハエを麻酔するために使用することができますが、それはもはや心拍数とリズムに永続的な効果を持っているとしてCO 2が推奨されていません。
- 麻酔ハエは、ワセリンの薄層でコーティングされたシャーレに、背側を下に、配置されます。疎水性のゼリーの翼と体可逆的に"スティック"のクチクラが、必要に応じその場を再配置することができます。これは、後続の操作時に特に重要になります。
- 最初のカットは、春のはさみ（Roboz＃5611）の湾曲したペアを使用して行われます。はさみブレードは、足の下に置き、首の近くに胸部の背面に向かって傾斜している。頭、腹側神経索、および脚はシングルカットで削除されます。準備をして酸素、人工血リンパ（AH）溶液中に浸漬される。
- 春のはさみを使用して、腹部（腹部セグメント7と8で構成される）の後部先端は、シングルカットで削除されます。これは腹部の両エッジに沿って横方向のカットを行うためのアクセスを提供し、後腸、腹部キューティクルの間の接続を切断するのに役立つ。腹側腹部キューティクルの解放されたフラップはその後削除されます。
- 腹部の臓器は今だけtracheolsによって所定の位置に保持されているように手順3と4で腸の前部と後部の接続が切断されています。腸や他の腹部臓器は通常、宝石商の鉗子（Roboz、＃55）と揺さぶる優しいを使用して単一の塊として除去することができます。内臓を削除しても、まだ脂肪体に囲まれて背側クチクラに接続されている心臓の鼓動のチューブを明らかにする。
- 脂肪体は、結果としてそれは明らかに心臓のチューブを確認するために、この脂肪の一部を削除する必要がしばしばある光学顕微鏡では非常に不透明です。これは、細かく描かれたガラスキャピラリーを用いた脂肪吸引の技術によって実現されます。毛細血管は、標準的なピペットプラー（例：サッターP - 97ピペットプラー）を使用して作られていますし、真空源に接続されているプラスチック製のチューブ（タイゴン、1 / 16"）に挿入されます。このシステムは、心臓の管の周りから余分な脂肪から吸引するために使用されます。直径40ミクロンよりも大きなヒントとピペットを使用するべきではありませんので、吸引力は、先端の直径に比例する。心臓の後方部分はこの地域を完全に回避する必要があることを非常に壊れやすいので細心の注意は、心臓自体に触れないように注意しておく必要があります。
- 成体ショウジョウバエの心臓の管が、現在公開され、暴行されるべきである。必要に応じて、キューティクルと接続された心を穏やかにワセリンからキューティクルを持ち上げ、慎重に背部の下のそれを突き、再び心臓組織との接触を避けることによって再配置することができます。 tにおける彼のポイントは、準備の入浴ソリューションは、新鮮なAHLに置き換える必要があります。この調製物は、前の任意の操作に酸素20〜30分間平衡を許可する必要があります。準備が60分以上維持する場合、それは新鮮なAHLで灌流してください。
光記録のための固定化ショウジョウバエの幼虫
- Sylgardのカバーガラスの各コーナーに近いHistoacryl接着剤の滴を配置。接着剤の滴にB＆Bバッファー50μlのを追加している硬化が即座になります。 B＆Bで接着されたスポットの間にスペースを埋める - 接着剤は、スライド上にバッファを保持します。
- 放浪L3の幼虫を取り、2分間氷上でウェットティッシュの紙の上に置きます。これは、その動きが遅くなります。その後、バッファと東洋背側を上に（これは歯状突起のベルトを欠いている幼虫の側面である）とそれに幼虫を移す。すぐに頭部とSylgardの間にいくつかの接着剤を適用する。接着剤は硬化が非常に速くなりますし、移動から幼虫の頭部を防ぐ。
- 鉗子を使用すると、慎重に後部気門によって動物をつかみ、ゆっくりとストレッチ。後半では幼虫の両側に沿って接着剤を適用することによって、この位置で幼虫を修正。体壁の筋肉がキューティクルのさらなる動きを減らすために、動物の脇腹に多くの接着剤を追加。幼虫は、今この位置に固定されています。カバースリップは、AHLまたはPBSで満たされた小さなペトリ皿に配置することができます。心臓の拍動は、現在、体壁の動きからの干渉なしに記録することができます。
代表的な結果：
新鮮な、酸素AHで維持するときに半無傷の成体ショウジョウバエの心臓は（補足データを参照して、Ocorr、ら、2007）解剖以下の時間のためにリズミカルに負かす事になります。代表的な例は、ムービー1に示します。第3齢幼虫と若ハエ（1 - 3週間後に羽化）からハーツ- 3 Hzの一般的に1の間のレートでの定期的なハートビートを示す。古いより3週間ハエは、一般的に不整脈であり、それにもかかわらず、これらの心はまだ酸素AHLで何時間も自然に打ち負かすことができます。解剖の手順の結果として損傷を受けている成人ハエの心は、一般的にリラックスすることができない極端な収縮の局所領域を示しています。 1Hzよりも遅いビートのレートはほとんど3週齢未満のハエでは観察されない。従ってそのような準備が破損すると破棄されると考えられている。
ムービー1をダウンロードするには、ここをクリック。 -露出腹部心管を示す一週間古い大人の野生型のハエ（W 1118実験室株）（左前方）。定期的な、リズミカルな収縮を注意してください。右上隅の不透明な領域が残っている腹部の脂肪体であり、心臓の両側に丸い細胞が心膜細胞である。
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Discussion
ショウジョウバエモデルでは、胎生発育から学習や記憶に至るまで、科学的なさまざまな質問に対処するために使用されている強力な遺伝学的ツールであることが証明されている。最近この多目的なモデル生物はハエの心機能の遺伝学を調査するために使用されています。成体ショウジョウバエで心臓生理学を定量化するための試行回数は、腹部のクチクラを通してそのままハエで行った観測に頼ってきた。これらのアプローチのほとんどは、単一のパラメータ、心拍数を定量化するために腹部を介して目視観察や光強度の送信機の変更の記録に頼ってきた。これらのメソッドはいくつかの制限があります：通常、心臓の前端を観察することができる、何が観察されていると、心臓の収縮に二次脂肪体の動きであり、心臓への神経入力はそのままです。成人半無傷準備は心拍数に加えて、パラメータの数の定量化を可能にする機能の心臓の大部分のより詳細なビューを提供します。それは録音の手順（Joveの記事を参照、1435）電気生理学的または光学的に使用することができます。さらに、この調製物は、組織学的操作（Joveの記事を参照、1435）に適しています。また、PCRのための比較的きれいな心臓の組織サンプル、ウェスタンブロッティング、マイクロアレイ解析、等として抽出することができます
ショウジョウバエの成体の心臓は、この解剖の目的のために、便利な翼形の筋肉のネットワークにより、腹部の背側クチクラに固定されています。このように頭と腹側に横たわっ神経索を離れて分析する、とし心を傷つけることなく、内臓を除去することができる。しかし、心臓は腹部の体節5月6日に拡張し、ペースメーカー細胞または細胞がこの地域では間違いなく存在している腹部の唯一の非常に先端をカットするために、ステップ3で極端な注意が必要です。
ケアは、解剖時に心臓に触れないように注意する必要があります。心との接触が疑われる場合の準備は破棄されるべきである。適度な吸引は通常、心臓の管のよりよい視覚化のために心臓を囲むが、過剰な吸引はまた、心臓に損傷を与える可能性脂肪とtracheolsの一部を削除すればよい。吸引力は、主に脂肪吸引のために使用されるピペットチップの大きさによって制御され、約40ミクロンよりも大きなヒントは避けるべきである。
成人とは異なり、ショウジョウバエの幼虫の心臓チューブは体腔内を移動するのは比較的自由です。このように半無傷の幼虫の心の準備は、光記録技術の難しさを示す。外皮の半透明のため、それは、明視野顕微鏡を使用して無傷の幼虫に心臓を視覚化することが可能です。ここで説明する接着剤技術は、あらゆる発達段階の幼虫を固定化し、固定位置に心を保つ。これは、比較的静止した心臓の管の録音を可能にします。このような固定された幼虫によって記録された心臓の収縮が続いてJoveの1435で説明されている光記録技術によって分析することができます。
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Acknowledgments
KOは、米国心臓協会からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
