Summary
Larva ve yetişkin kalpte görüntülenmesi için gerekli Tekniği
Abstract
Protocol
Başlamadan önce
Yetişkin kalpleri
- Taze yapay hemolimf (AH) 108mm Na içeren çözüm + 5mM K +, 2mm Ca 2 +, 8mm MgCl 2, 1mm NaH 2 PO 4, 4mm NaHCO 3, 10mM sakaroz, 5mM trehaloz, 5mM Hepes (pH 7.1, tüm reaktiflerin gelen hazırlamak Sigma Kimyasallar). Sakaroz ve trehaloz kullanımı, bakteri bulaşmasını önlemek için amacıyla hemen önce buzdolabında stok çözümleri AH eklendi olmalıdır.
- Oda sıcaklığında ve en az 15 dakika hava köpüren oksijen çözüm AH getirin.
- Yağ çıkarılması için gerekli pek çok ince kılcal damarlar (örn. Cam kılcal, 100ul, VWR) çekin.
Larvaların kalpleri
- Sylgard kaplı lamelleri: 22x22mm lamel üzerine Sylgard çözüm 50-70μl hakkında bir kürdan kullanarak, transfer. 65 ° C gece boyunca Sylgard sertleşmesine izin verin.
- Broadie ve Bate tamponu (; pH 7.15 Broadie ve Bate, 1993 135mm NaCl, 5mM KCl, 4mm MgCl 2, 2mm CaCl 2, 5mM TES, 36mm Sakkaroz) hazırlayın.
- Histoacryl tutkal uygulamak için gerekli araçları hazırlayın. İlk olarak, pek çok ince kılcal damarlar (örneğin Bilimi Ürünler GB100T8P) çekin. 1.5ml pipet ucu, küçük bir plastik tüp (Tygon, 1 / 32 ") tüp içine küçük ucunu takarak bağlayın. Diğer ucuna geniş açılması ile kılcal yerleştirin. , Tutkal ve nazik vakum plastik ucu içine bir damla içine kılcal daldırma Histoacryl yapıştırıcı ile kılcal yükleyin. Yapıştırıcı ile çalışırken bir ucundan kılcal tutkal aşırı yapıştırıcı kaldırmak için, elinizin altında kılcal ikinci bir cam olmalıdır. Birkaç saniye içinde. Sertleşmesine tamponlu salin ile temas kadar tutkal sıvıdır. Bununla birlikte, genellikle uzun numune uygularken tutkal kılcal ucundan ya da kaldırılabilir yeterli plastik kalır.
Yetişkin Fly Yarı sağlam Drosophila Kalp
- Yetişkin Drosophila sinekleri 2-5 dakika Fly Nap (Carolina Biyolojik Supply Co) ile anestezi. Uzun pozlama için Fly Nap sinekler bırakmamaya dikkat edilmelidir. Sinekler uyutmak için kullanılan soğuk Kısa süreli maruz kalma da olabilir ama daha uzun, kalp hızı ve rhythmicity kalıcı etkileri olduğu gibi CO 2 tavsiye edilmez .
- Anestezi sinekler, dorsal yüzü aşağı, ince bir tabaka vazelin ile kaplı bir Petri kabı içine yerleştirilir. Kanat ve gövde hidrofobik manikür geri dönüşümlü jöle "sopa" ama sinek gerekirse yeniden konumlandırılmış olabilir. Bu sonraki manipülasyonlar sırasında özellikle önem kazanmaktadır.
- Bir ön kesme, yaylı makas eğri çifti (Roboz # 5611) kullanılarak yapılır. Makas bıçakları, bacakların altına yerleştirilen ve boyun yakın toraks dorsal yüzeyine doğru açılı. Baş, ventral sinir kablosu, ve bacaklar, tek bir kesim ile kaldırılır. Hazırlık sonra oksijenli, yapay hemolimf (AH) çözümü batmış.
- Yaylı makas kullanmak karın arka ucu (7 ve 8 karın segmentleri oluşan) için tek bir kesim ile kaldırılır. Bu karın hem kenarları boyunca yanal kesim yapmak için erişim sağlar ve arka bağırsak ve karın manikür arasındaki bağlantıyı koparmak için hizmet vermektedir. Ventral karın manikür serbest flep sonra kaldırılır.
- Karın içi organların artık sadece tracheols tarafından yerinde tutulur, böylece 3. ve 4. adımları bağırsak ön ve arka bağlantıları kopmuş. Gut ve diğer karın içi organların genellikle kuyumcu forseps (Roboz, # 55) ve nazik asılarak kullanarak tek bir kitle olarak çıkartılabilir. Iç organların çıkarılması hala yağ organları tarafından çevrili dorsal manikür bağlı kalpte tüpü ortaya koymaktadır.
- Yağ cisimlerinin dolayısıyla bazı kalp tüpü açık bir şekilde görmek için bu yağ çıkarmak için sık sık gerekli ışık mikroskobu oldukça opak. Bu ince çekilmiş cam kapilerleri kullanarak bir liposuction tekniği ile gerçekleştirilir. Kılcal damarların bir standart pipet çektirmesi (Örnek Sutter P-97 Pipet Çektirme) kullanılarak yapılır ve ardından bir vakum kaynağına bağlı plastik boru (Tygon, 1 / 16 ") içine yerleştirilir. Bu sistem, kalp tüpü etrafında aşırı yağ kapalı emme için kullanılır. Emiş gücü, çapı 40 mikrondan daha büyük ipuçları ile pipetler kullanılmamalıdır böylece ucu çapı ile doğru orantılıdır. Kalbin arka kısmı çok hassas bölge tamamen kaçınılması gerektiğini, çünkü çok dikkatli, kalbin kendisi dokunmaktan kaçının ve alınmalıdır.
- Yetişkin Drosophila kalp tüpü şimdi maruz kaldığı dayak olmalıdır. Gerekirse kütikula ve ekli kalp hafifçe vazelin manikür kaldırma ve tekrar geri aşağı dikkatle tamping kalp dokusu ile herhangi bir temas kaçınarak yeniden konumlandırılmış olabilir. Tonun noktası hazırlık banyo çözüm taze AHL ile değiştirilmesi gerekir. Bu preparat oksijenasyonu ile 20-30 dakika önce her türlü manipülasyonlar denge sağlaması için izin verilmelidir. Hazırlık, 60 dakikadan daha uzun süre muhafaza edilecekse taze AHL ile perfüze edilmelidir.
Drosophila larvaları optik kayıt için hareketsizleştirir
- Histoacryl tutkal Sylgard lamelleri her köşesine yakın bir damla yerleştirin. Sertleşmesine anında B & B tutkal damlaları tampon 50μl ekle Tutkal slayt tampon tutacak - B & B ile yapıştırılmış noktalar arasındaki boşluğu doldurun.
- Göçebe bir L3 larva alın ve ıslak kağıt mendil parçası üzerinde 2 dakika süreyle buz koyun. Bu hareketini yavaşlatır. Ardından tampon ve şark dorsal yüzü yukarı (larva diş gibi çıkıntı kemerleri yoksun tarafı) ile larva transferi. Baş bölgesi biraz tutkal ve Sylgard arasında hızla uygulanır. Tutkal sertleşerek çok hızlı ve hareketli larva başkanı önlemek.
- Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde arka spiracles hayvan kapmak ve hafifçe germek. Larva larva her iki taraf posterior yarısı boyunca tutkal uygulayarak bu pozisyonda sabitleyin. Manikür daha fazla hareket, vücut duvarı kasları azaltmak için hayvan yanları daha fazla tutkal eklemek. Larva, şimdi bu konumda sabit. Lamel AHL veya PBS ile dolu küçük bir Petri kabı içine yerleştirilebilir. Kalp atım şimdi müdahalesi olmaksızın vücut duvarı hareketleri kaydedilebilir.
Temsilcisi Sonuçlar:
Taze, oksijenli AH bakımı yapıldığında yarı sağlam bir yetişkin Drosophila kalp diseksiyonu aşağıdaki (bkz. Ek Veri Ocorr ve ark, 2007) saat boyunca ritmik yendi. Movie 1 temsili örnek gösterilmiştir. 3. instar larva ve genç sinekler (1-3 hafta eclosion) Hearts - 3 Hz genellikle 1 ile oranları düzenli bir kalp atışlarını gösterir. Yine de, bu kalpleri hala oksijenli AHL saat için kendiliğinden yenmek mümkün, 3 hafta genellikle daha aritmik büyük uçar. Hearts diseksiyonu prosedürün bir sonucu olarak zarar görmüş yetişkin sinekler genellikle aşırı daralma dinlenmek için mümkün olan lokalize bölgelerde göstermektedir. Dolayısıyla bu tür hazırlıkları hasarlı olarak kabul edilir ve atılır; 1 Hz daha yavaş Heartbeat oranları yaş 3 hafta daha genç uçar nadiren gözlenir.
Movie 1 indirmek için buraya tıklayın maruz kalan karın kalp tüpü gösteren bir haftalık yetişkin wild tip sineği (w 1118 laboratuvar suşu) (sol anterior). Düzenli, ritmik kasılmaları Not. Opak bölgelerde sağ üst köşesinde, kalan karın yağ organları, kalbin her iki tarafında yuvarlak hücreler perikardiyal hücreleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila modeli embriyolojik gelişim öğrenme ve hafıza arasında değişen çeşitli bilimsel soruları gidermek için kullanılan güçlü bir genetik bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda bu çok yönlü bir model organizmanın genetik kalp fonksiyon sinek araştırmak için kullanılır olmuştur. Yetişkin Drosophila kalp fizyolojisi ölçmek için bir dizi girişimi sağlam sineklerin karın manikür yoluyla yapılan gözlemlere dayanıyordu. Bu yaklaşımların çoğu, tek bir parametre, kalp hızı ölçmek için karın ile ışık yoğunluğu verici görsel gözlem veya değişiklik kayıtları dayanıyordu. Kutlanıyor kalp kasılmaları ikincil yağ cisimlerin hareketi, genellikle sadece kalbin ön ucunu görülebilir ve kalp sinir giriş bozulmamış: Bu yöntemler çeşitli sınırlamalar var. Yetişkin yarı sağlam hazırlık ek olarak kalp hızı parametreleri bir dizi işleyen kalp izin kantifikasyon büyük bir bölümünü daha ayrıntılı bir görünümünü sağlar. Bu kayıt işlemleri (vallahi makalesine bakın, 1435) elektrofizyolojik veya optik için de kullanılabilir. Buna ek olarak, bu hazırlık (Jüpiter makalede, 1435), histolojik manipülasyonlar için uygundur. Ayrıca PCR nispeten temiz bir kalp doku örneği olarak elde edilebilir, Western blot, mikroarray analizi, vb.
Drosophila yetişkin kalp, bu diseksiyon amaçlar için, uygun alary kasların bir şebeke tarafından karın dorsal manikür sabittir. Böylece uzakta, baş ve karın yalan sinir kablosu incelemek ve daha sonra kalp zarar vermeden iç organları kaldırmak mümkündür. Ancak, 3. adımda, kalp, karın segmentinde 5 / 6 içine doğru uzanır ve sadece karın çok uç bir kalp pili hücre veya hücreleri hiç kuşkusuz bu bölgede mevcut olarak kesmek için çok dikkatli olmalıdır.
Bakım diseksiyonu sırasında kalp dokunmaktan kaçının alınmalıdır. Eğer kalp ile temas şüphelenilen hazırlık atılmalıdır. Orta emme genellikle kalp kalp tüpü daha iyi görselleştirme ancak aşırı emme çevreleyen yağ ve tracheols bazıları da kalbin zarar verebilir kaldırmak için yeterlidir. Emiş gücü öncelikle liposuction için kullanılan pipet ucu boyutuna göre kontrol edilir, yaklaşık 40 mikrondan daha büyük ipuçları kaçınılmalıdır.
Drosophila larva kalp tüp yetişkin aksine, vücut boşluğunda hareket etmek nispeten ücretsizdir. Böylece yarı sağlam larva kalp hazırlama, optik kayıt teknikleri için zorluklar sunar. Kabuklarıyla translusensi nedeniyle aydınlık mikroskopi kullanılarak sağlam larva kalp görselleştirmek mümkün. Burada açıklanan yapıştırıcı tekniği herhangi bir gelişimsel aşamada larva durduran ve sabit bir pozisyonda kalp tutar. Bu nispeten durağan bir kalp tüpü kayıt izin verir. Kalp kasılmaları gibi hareketsiz larva tarafından kaydedilmiş, daha sonra Jüpiter 1435 yılında açıklanan optik kayıt tekniği ile analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KO Amerikan Kalp Derneği bir hibe ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro Dissecting Spring Scissors (curved) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5611 | Good for gross cuts (Step 3) |
| Micro Dissecting Spring Scissors (straight) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5620 | |
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Glass Capillaries, 100ul | VWR international | 53432-921 | |
| Glass Capillaries, fine | Science Products | GB100T8P | |
| Pipette Puller | Sutter Equipment | P-97 | Both horizontal and vertical pipette pullers will work |
| Plastic tubing | Tygon | 1/16” inner diameter | for 100μl capillaries |
| Plastic tubing | Tygon | 1/32” inner diameter | for small capillaries |
| Histoacryl® tissue adhesive | B. Braun Medical |
References
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J Neurosci. 13, 144-166 (1993).
