Summary
Nous avons développé une méthode semi-automatisée d'analyse optique Heartbeat (SOHA) pour l'analyse des enregistrements optiques très haut débit à partir
Abstract
Nous avons développé une méthode d'analyse des enregistrements optiques très haut débit à partir
Protocol
Cliquez ici pour voir un aperçu de l'analyse semi cardiaque automatisé (SOHA) procédure.
Semi-automatique d'analyse battement optique
1. Prétraiter -
Cette étape donne des informations sur les diamètres cardiaque diastolique et systolique.
Bords de coeur sont identifiées et marquées pendant la diastole et systole maximale. Enregistrements optiques peuvent être avancées à des vitesses lentes et même une image à un moment permettant l'identification précise des images où la contraction et la relaxation maximale du cœur se produisent. Une paire de marques d'identification des bords diastolique et une paire d'identifier les bords systolique sont faites. Les marques peuvent aussi être faites en double exemplaire à différents endroits le long du coeur horizontale.
Les diamètres du cœur obtenue dans cette étape sont également utilisés pour calculer une mesure supplémentaire qui fournit une estimation de la contractilité du cœur. Cette mesure est le raccourcissement fractionnel pour cent (% FS) et elle représente la mesure dans laquelle les bords du cœur vers l'autre lors d'une contraction. La formule utilisée pour calculer% FS est la suivante:
(((Diamètre diastolique - diamètre systolique) / diamètre diastolique) x 100)
Remarque - Les points identifiés dans cette série sont utilisés uniquement pour les mesures de diamètre et la fraction de raccourcissement et ne sont pas utilisés pour la détection de mouvement.
Exemple: (. Cammarato, et al 2008) Chez la drosophile, des mutations ponctuelles dans le domaine du transducteur chaînes lourdes de myosine, une région connue pour moduler l'activité enzymatique du moteur, résultat dans les coeurs qui sont dilatés ou restreinte selon qu'ils suppriment ou améliorer l'activité myosine de l'ATPase . Ces types de mesures ne peut être faite dans les mouches intact comme il n'est généralement pas possible d'identifier les bords du cœur sur toute la longueur du tube de cœur à travers la cuticule et la graisse, (comparez type sauvage, D45 et Mhc5 M-modes dans "M-mode Figure "ci-dessous) qui, normalement, entourent le cœur. Les mesures faites au moment de visualiser le cœur de mouches intacte avec d'autres méthodes couramment employées sont généralement limités à la partie la plus antérieure du cœur, la région de chambre conique. Il n'est également pas possible d'obtenir cette mesure dynamique dans des tissus fixés.
2. Détection de Mouvement
Cette étape se fait automatiquement par le programme et utilise deux algorithmes différents pour analyser les mouvements de chaque film. Brièvement, le premier algorithme, le "Darkness Moyenne Frame" algorithme utilise un châssis par l'approche du cadre. Cela représente en moyenne algorithme de l'intensité obscurité pour une trame film entier, normalise la valeur d'un intervalle entre 0 et 1, et les parcelles de la moyenne normalisée pour chaque trame dans le film au cours du temps. La deuxième approche, le "pixel par pixel" algorithme, analyse les changements dans les ténèbres de l'ensemble des pixels individuels d'une image à la suivante. Pixels qui présentent des changements d'intensité au-dessus d'un seuil prédéfini sont additionnées pour chaque trame et tracées pour chaque trame dans le film au cours du temps.
3. Vérifiez Intervalles-
La sortie des deux algorithmes de détection de mouvement est affiché dans ce module avec le "Darkness moyenne" de sortie s'affiche dans une fenêtre au-dessus du "pixel par pixel" fenêtre de sortie. Afin d'être sûr que les intervalles de détection d'accord avec le mouvement dans le film nous affichons une réelle bord trace ou en mode M faite à partir des images en cours d'analyse directement sous les fenêtres de sortie algorithme. Le mode M est fait par tranches de coupe numériquement un pixel de largeur à travers le cœur de chaque trame dans le film et de les aligner horizontalement pour fournir un instantané des mouvements pointe du cœur au cours du temps. Dans le "pixel par pixel" fenêtre de l'intervalle identifié diastolique sont indiqués par une ligne horizontale verte avec le nombre d'images qui contribuent à cet intervalle directement au-dessus. Intervalles systoliques sont identifiés comme étant l'intervalle entre deux diastoles successives. Le début d'une systole est indiqué dans le mode M par une ligne verticale bleue et la fin est indiquée par une ligne verticale rouge. Avec cet affichage, il est relativement facile de voir si la sortie de l'algorithme est d'accord avec les mouvements du cœur réel.
Bien que la détection de mouvement est effectuée automatiquement la sortie doit être vérifié l'exactitude. Il ya plusieurs raisons à cela: l'une est qu'il ya souvent un sous-jacent, la fluctuation des niveaux d'ondes lentes de lumière n'est pas liée au mouvement du cœur. Ceci peut habituellement être éliminés par l'utilisation d'un construit en filtre passe-haut. Une deuxième raison a trait à la sensibilité du "pixel par pixel". La sortie de cet algorithme est généralement de deux traces du mouvement, un pour le mouvement de contraction et un pour le mouvement de détente. En plus les mouches et dans certains mutants de la longueur de temps entre ces deux mouvements devient relativement longue et le programme tente d'interpréter les deux mouvements que deux battements séparés. Ceci peut être corrigé en demandant au programme de comparer la sortie du pixel par pixel avec algorithme de celle de l'algorithme de Ténèbres de trame moyenne, en cliquant sur les "ténèbres Utilisez« boîte.
Exemple (voir vidéo): Dans 5 à 7 semaines mouches les intervalles systolique sont généralement beaucoup plus longue que chez les mouches jeunes. Ces longs intervalles sont d'abord détectés comme deux contractions séparés par un diastole courte. Ceci peut être corrigé en sélectionnant les «ténèbres Utilisez" case à cocher. Dans ce cas, le programme permettra de comparer l'intervalle diastolique identifiés par le pixel par pixel avec l'algorithme de la sortie Ténèbres trame moyenne. Si la sortie de trame moyenne Ténèbres a une valeur positive, alors tout intervalle diastolique identifiés dans le pixel par pixel l'algorithme sera ignoré et les intervalles seront correctement spécifiés. Le film entier peuvent être numérisés en 10 segments deuxième et accepté (cliquez sur "OK Données") ou rejetée (cliquez sur "Jeter des données»). Le Salut et les sensibilités passent Lo filtre peut être ajustée manuellement pour aider à définir plus précisément les intervalles de contraction lors de l'utilisation de l'algorithme Ténèbres.
4. Statistiques-sorties
Une fois la sortie pour un film donné a été accepté, le programme va utiliser ces informations pour calculer automatiquement un certain nombre de paramètres. Il s'agit notamment de l'intervalle systolique et diastolique, la période cardiaque et du rythme cardiaque, la direction et la vélocité de l'onde de contraction FS, diamètres du cœur, et%. En outre, le programme a de multiples méthodes pour quantifier arrhythmicity reflétant non uniforme contraction et la relaxation des cycles (voir Fink et al, 2009). Sortie de la statistique est fournie pour chaque film individuellement et pour l'ensemble des données sous la forme d'une valeur séparées par une virgule (. Csv) qui peut être ouvert dans un tableur comme Microsoft Excel.
Tableau 1 -
Un exemple de la sortie générée par le semi-automatique du programme Cœur analyse optique.
5. Mise à jour Histogrammes-
Cette partie du programme affiche toutes les données sur les intervalles de coeur pour un jeu de données dans le format histogramme. Depuis les fréquences cardiaques sont variables, nous normaliser les données de sortie histogramme. Cependant, parce que la distribution des intervalles n'est pas symétrique autour d'une moyenne, nous utilisons la valeur médiane de l'intervalle de notre normalisation.
Exemple (voir vidéo): Les mouches qui sont mutantes pour le canal potassique KCNQ montrent extrêmement irrégulières intervalles systolique et diastolique. Généralement, les intervalles systolique sont beaucoup plus longs et plus irrégulières que dans appariés selon l'âge des mouches de type sauvage. Cela peut être clairement perçue par l'affichage des données en format histogramme (voir aussi Ocorr et al. 2007).
6. Le mode M-
Ce module génère M-modes qui peuvent être fabriqués à partir de n'importe quelle position le long du cœur dans le cadre du film. La longueur de la M-mode peut aussi être spécifiée. M-modes sont utiles pour montrer qualitativement ce que le cœur est fait dans un film.
Exemple (voir vidéo): Film d'un cœur de poisson zèbre vieilles trois jours les larves montrant le ventricule antérieur qui est utilisée pour générer un M-mode. La tranche verticale de pixels qui seront excisés électronique de chaque cadre du film est indiquée par une ligne rouge.
Le mode M Figure: Exemples de M-modes de la drosophile et le poisson zèbre. Une des mutations myosine discuté dans les résultats Prétraiter étape dans un moteur moléculaire avec la cinétique enzymatique rapide entraînant une restriction coeur et parfois un bloc de conduction. Les deux paramètres peuvent être montré qualitativement à l'aide de M-modes. 
M-modes fait dans la même partie du cœur dans les deux de type sauvage et mouches mutantes montrent clairement le phénotype restreint dans le CMH 5 mutants et les diamètres dilatés et cycles de contraction arythmique du mutant D45 (qui exprime la myosine avec la cinétique enzymatique déprimés) (modifié à partir Cammarato et al., 2008).
M-mode fabriqués à partir d'un cœur Zebrafish larves montrant le ventricule antérieur (film même cœur, comme indiqué dans la démonstration, Fink et al 2009).
7. Red Dot Movie-
Ce module génère automatiquement un ralenti (1:4), 20 seconde version d'un film montrant analysé tous les pixels qui sont identifiés comme changer en rouge. Cette fonctionnalité est principalement utilisée à des fins d'illustration.
Film 1 - Un "film red dot» montrant les pixels qui sont identifiés comme ayant les changements d'intensité obscurité par les algorithmes du programme en rouge. La vitesse de film est ralenti par rapport à l'original par un facteur 4.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Cliquez ici pour télécharger la vidéo 1.
8. Les demandes additionnelles-
Nous avons commencé à appliquer ce système d'analyse pour les films à haute vitesse des autres modèles avec des petits coeurs qui sont souvent difficiles à analyser en utilisant la méthodologie traditionnelle. Nous avons appliqué avec succès cette analyse à la fois le poisson-zèbre cœur des larves et des cœurs embryonnaires de souris (Fink et al, 2009).
Film 2 - film coeur de la souris ainsi que la figure avec des intervalles vérifier avec la sortie des données.
Cliquez ici pour télécharger Movie 2. 
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Discussion
Le modèle de drosophile s'est avérée être un puissant outil génétique qui a été utilisée pour traiter une variété de questions scientifiques allant du développement embryologique de l'apprentissage et la mémoire. Récemment cet organisme modèle polyvalent a été utilisé pour étudier la génétique de la fonction cardiaque. Un certain nombre de tentatives pour quantifier la physiologie cardiaque chez les adultes de drosophile sont appuyés sur les observations faites chez des mouches intacte à travers la cuticule abdominale. La plupart de ces approches dépendent observation visuelle ou les enregistrements des variations de l'intensité lumineuse transmise à travers l'abdomen de quantifier un seul paramètre, la fréquence cardiaque. Bien que ce paramètre est utile, elle est limitée dans ce qu'elle nous dit sur la fonction cardiaque. Notre méthode semi-automatique d'analyse optique Heartbeat est une approche robuste pour dériver des informations précises sur un certain nombre de paramètres supplémentaires importants à partir de films à haute vitesse de battre les cœurs et de le faire pour chaque battement de coeur dans un dossier.
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Acknowledgments
KO et AC sont soutenus par une subvention et une bourse de l'American Heart Association. SIB et RB sont soutenus par des subventions du NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
