Summary
Hemos desarrollado un método semi-automatizado de análisis óptico Heartbeat (SOHA) para el análisis de grabaciones de alta velocidad óptica de
Abstract
Hemos desarrollado un método para el análisis de grabaciones de alta velocidad óptica de
Protocol
Semi-automatizado de análisis óptico de latidos del corazón
1. Preprocesar -
Este paso ofrece información sobre los diámetros cardíaca diastólica y sistólica.
Los bordes del corazón son identificados y marcados durante la diástole y la sístole máxima. Grabaciones ópticas se puede avanzar a baja velocidad e incluso un cuadro a la vez que permite la identificación precisa de los marcos donde la máxima contracción y relajación del corazón se producen. Un par de marcas de identificación de los bordes diastólica y un par la identificación de los bordes sistólica se hacen. Las marcas también se puede hacer en dos ejemplares en diferentes lugares a lo largo de la horizontal del corazón.
Los diámetros de corazón obtenido en esta etapa también se utilizan para calcular una medida adicional que proporciona una estimación de la contractilidad del corazón. Esta medida es el acortamiento fraccional por ciento (% FS) y representa el grado en que los bordes del corazón se mueven una hacia la otra durante una contracción. La fórmula utilizada para calcular FS% es:
(((Diámetro diastólico - diámetro sistólico) / diámetro diastólico) x 100)
Nota - Los puntos identificados en este grupo sólo se utilizan para las mediciones de diámetro y fraccionada acortamiento y no se utilizan para la detección de movimiento.
Ejemplo: (. Cammarato, et al 2008) En Drosophila, mutaciones puntuales en el dominio del transductor de la cadena pesada de la miosina, una región conocida para modular la actividad enzimática del motor, resultado en los corazones que se dilatan o restringido en función de si se suprimen o aumentan la actividad miosina de ATPasa . Este tipo de medidas no se pueden hacer en las moscas intacta, ya que generalmente no es posible identificar a los bordes del corazón a lo largo de toda la longitud del tubo de corazón a través de la cutícula y la grasa, (compare tipo salvaje, D45 y Mhc5 M-modos en "modo-M La figura "más abajo) que normalmente rodean el corazón. Las mediciones realizadas en la visualización del corazón en las moscas intacta con otros métodos comúnmente empleados son por lo general limitada a la porción más anterior del corazón, la región cámara cónica. Tampoco es posible obtener esta medición dinámica en el tejido fijado.
2. Detección de Movimiento-
Este paso se realiza automáticamente por el programa y usa dos algoritmos diferentes para analizar el movimiento de cada película. En pocas palabras, el primer algoritmo, el "Darkness Media Frame" algoritmo utiliza un marco de enfoque del marco. Esto da un promedio algoritmo de la intensidad de la oscuridad de un marco de toda la película, se normaliza el valor de un intervalo entre 0 y 1, y las parcelas de la media normalizada para cada fotograma de la película a través del tiempo. El segundo enfoque, el "pixel por pixel" algoritmo, analiza el cambio en la oscuridad de todos los píxeles individuales de un fotograma a otro. Los píxeles que muestra los cambios de intensidad por encima de un umbral predeterminado se suman para cada fotograma y se representa para cada fotograma de la película a través del tiempo.
3. Intervalos de comprobar-
La salida de los dos algoritmos de detección de movimiento se muestra en este módulo con la "oscuridad promedio" de salida en una ventana por encima del "pixel por pixel" ventana de salida. Con el fin de estar seguros de que los intervalos de detección de acuerdo con el movimiento en la película actual que muestra un borde de seguimiento o en modo M a partir de los marcos que se analiza directamente debajo de las ventanas algoritmo de salida. El modo M se realiza digitalmente cortar rodajas de un píxel de ancho a través del corazón de cada fotograma de la película y su alineación horizontal para proporcionar una instantánea de los movimientos del corazón ventaja en el tiempo. En el "pixel por pixel" ventana de los intervalos identificados diastólica se indican mediante una línea horizontal verde con el número de fotogramas que contribuyen a que el intervalo situado encima. Intervalos sistólica se identifican como el intervalo entre dos sucesivas diástoles. El comienzo de una sístole se indica en el modo M por una línea vertical azul y al final se indica con una línea roja vertical. Con esta pantalla es relativamente fácil de ver si la salida del algoritmo está de acuerdo con los movimientos del corazón real.
Aunque la detección de movimiento se realiza de forma automática la salida debe ser verificada. Hay varias razones para esto: una es que a menudo hay una fluctuación de base, ondas lentas en los niveles de luz no están relacionadas con el movimiento del corazón. Esto se puede eliminar mediante el uso de una construida en filtro de paso alto. Una segunda razón tiene que ver con la sensibilidad del "pixel por pixel" enfoque. La salida de este algoritmo suele ser de dos huellas movimiento, uno para el movimiento de contracción y otra para el movimiento de relajación. En las moscas y los mayores en algunos mutantes de la longitud de tiempo entre estos dos movimientos llega a ser relativamente larga y el programa trata de interpretar los dos movimientos como dos ritmos diferentes. Esto se puede corregir haciendo el programa para comparar la salida del pixel por pixel con el algoritmo del algoritmo marco oscuridad media, haciendo clic en la "oscuridad utilizar".
Ejemplo (ver video): de 5 a 7 semanas de edad, las moscas de los intervalos sistólica suelen ser mucho más largo que en las moscas de los jóvenes. Estos intervalos de tiempo se detectan inicialmente como dos contracciones separados por un diástole corta. Esto se puede corregir mediante la selección de la "oscuridad uso" casilla de verificación. En este caso, el programa comparará el intervalo diastólico identificados por el pixel por pixel algoritmo con la salida de Marco oscuridad media. Si la salida de Marco oscuridad promedio tiene un valor positivo, entonces cualquier intervalo diastólico identificados en el pixel por pixel algoritmo se tendrá en cuenta y los intervalos se ha especificado correctamente. Toda la película se pueden explorar en 10 segmentos segundo y aceptados (haga clic en "Aceptar datos") o rechazar (haga clic en "Eliminar datos"). La alta sensibilidad y Lo filtro de paso se pueden ajustar manualmente para ayudar a definir con mayor precisión los intervalos de contracción cuando se emplea el algoritmo de la Oscuridad.
4. Estadísticas de salida
Una vez que la salida de una película determinada ha sido aceptada, el programa utilizará esa información para calcular de forma automática una serie de parámetros. Estos incluyen intervalo diastólico y sistólico, el período y la frecuencia cardíaca, la dirección y velocidad de la onda de contracción FS, diámetro del corazón, y%. Además, el programa cuenta con múltiples métodos para la cuantificación de arrhythmicity refleja no uniforme y los ciclos de contracción relajación (ver Fink et al, 2009). Producción estadística es proporcionada por cada película de forma individual y para el conjunto completo de datos en forma de valores separados por comas (. Csv) que se puede abrir en programas de hojas de cálculo como Microsoft Excel.
Tabla 1 -
Un ejemplo de la salida generada por el semi-automatizado programa de análisis óptico del corazón.
5. Actualización de histogramas-
Esta parte del programa muestra todos los datos en intervalos de corazón por un conjunto de datos en formato de histograma. Dado que la frecuencia cardíaca son variables que normalizar los datos de salida del histograma. Sin embargo, debido a la distribución de los intervalos que no es simétrica alrededor de una media que utilizar el valor de la mediana del intervalo de nuestra normalización.
Ejemplo (ver video): Las moscas que son mutantes para el canal de potasio KCNQ mostrar intervalos diastólica y sistólica muy irregular. Normalmente los intervalos de presión sistólica es mucho más largo y más irregular que en la misma edad moscas de tipo salvaje. Esto puede verse claramente al mostrar los datos en formato de histograma (véase también Ocorr et al. 2007).
6. M-mode-
Este módulo genera M-modos que se pueden hacer desde cualquier posición a lo largo del corazón en el marco de la película. La longitud de la M-modo también se puede especificar. M-modos son útiles para mostrar cualitativamente lo que el corazón está haciendo en una película.
Ejemplo (ver video): Película de un corazón del pez cebra 3 días de edad larval mostrando el ventrículo anterior que se utiliza para generar un modo-M. El corte vertical de píxeles que se extirpa de forma electrónica a cada fotograma de la película se indica mediante una línea roja.
En modo M Figura: Ejemplos de M-modos de Drosophila y pez cebra. Una de las mutaciones miosina discutido en los resultados de preproceso paso en un motor molecular con la cinética de enzimas más rápido que resulta en la restricción del corazón y de vez en cuando un bloqueo de conducción. Ambos parámetros se pueden mostrar cualitativamente mediante la M-modos. 
M-modos de hecho en la misma porción del corazón en ambos de tipo salvaje y las moscas mutantes que muestran claramente el fenotipo restringido en el MHC 5 mutantes y los diámetros de dilatación y contracción de los ciclos de arritmia del mutante D45 (que expresa la miosina con la cinética de enzimas depresión) (modificado de Cammarato et. al, 2008).
En modo M a partir de un corazón larvas de pez cebra que muestra el ventrículo anterior (película de mismo corazón, como se muestra en la manifestación, Fink et.al. 2009).
7. Red Dot Movie-
Este módulo genera automáticamente un frenado (1:4), 20 la segunda versión de una película que muestra analizada todos los píxeles que se identifican como el cambio de color rojo. Esta característica se utiliza principalmente para fines de ilustración.
Movie 1 - Una "película punto rojo" que muestra los píxeles que están identificadas como de los cambios de intensidad la oscuridad por los algoritmos del programa en rojo. La velocidad de la película se hace más lenta de la original por un factor de 4.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Haga clic aquí para descargar la película 1.
8. Aplicaciones adicionales-
Hemos comenzado a aplicar este sistema de análisis de películas de alta velocidad de otros modelos con pequeños corazones que a menudo son difíciles de analizar utilizando la metodología tradicional. Hemos aplicado con éxito este análisis a los dos corazones larvas de pez cebra y en los corazones de embriones de ratón (Fink et al, 2009).
Movie 2 - película del ratón corazón, más la figura con los intervalos de chequeo con salida de datos.
Haga clic aquí para descargar la película 2. 
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Discussion
El modelo de Drosophila ha demostrado ser una potente herramienta genética que se ha utilizado para tratar una variedad de problemas científicos que van desde el desarrollo embrionario para el aprendizaje y la memoria. Recientemente, este organismo modelo versátil se ha utilizado para investigar la genética de la función cardíaca. Un número de intentos de cuantificar la fisiología del corazón en adultos de Drosophila se han basado en observaciones realizadas en las moscas intacta a través de la cutícula abdominal. La mayoría de estos métodos dependen de la observación visual o grabaciones de los cambios en la intensidad de luz transmitida a través del abdomen de cuantificar un solo parámetro, la frecuencia cardíaca. Aunque este es un parámetro útil es limitada en lo que nos dice acerca de la función cardíaca. Nuestro método semi-automatizado de análisis óptico latido del corazón es un método eficaz para derivar información precisa acerca de un número adicional de parámetros importantes de las películas de alta velocidad de corazones palpitantes y de hacerlo para cada latido del corazón de un registro.
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Acknowledgments
KO y AC son apoyados por una beca y beca a de la Asociación Americana del Corazón. SIB y RB son apoyados por las subvenciones del NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
