Summary
Biz yüksek hızlı optik kayıtları analiz etmek için geliştirilen bir Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analiz yöntemi (Soha)
Abstract
Biz yüksek hızlı optik kayıtları analiz etmek için bir yöntem geliştirdi.
Protocol
Yarı otomatik kalp atışı analizi (Soha) prosedürünün bir bakış görmek için buraya tıklayın.
Yarı-otomatik optik kalp atışı analizi
1. Önişlem -
Bu adım, diyastolik ve sistolik kalp çapları hakkında bilgi sağlar.
Kalp kenarları maksimum diyastol ve sistol sırasında tespit ve işaretlenir. Optik kayıtları bile düşük hızlarda ve maksimal kalp kasılma ve gevşeme meydana gelen kare kesin kimlik sağlayan bir zamanda bir kare ileri olabilir. Bir çift, sistolik kenarları tespit diyastolik kenarları ve bir çift tespit işaretleri yapılır. Marks kalp boyunca farklı yatay noktada iki nüsha halinde de yapılabilir.
Bu adımda elde edilen kalp çapları aynı zamanda kalp kontraktilite bir tahmin sağlar ek bir ölçüm hesaplamak için kullanılır. Bu tedbir, yüzde fraksiyonel kısalma (FS) ve kalp bir daralma sırasında kenarları birbirine doğru hareket ölçüde temsil eder. % FS hesaplamak için kullanılan formül:
(((Diyastolik çapı sistolik çapı) / diyastolik çap) x 100)
Not - Bu sette tespit noktaları sadece çap ve fraksiyonel kısalma ölçümleri için kullanılır ve hareket algılama için kullanılmaz.
Örnek: (. Cammarato, ve ark 2008) Drosophila olarak nokta mutasyonlarının miyozin ağır zincir en transdüser etki alanı bilinen bir bölgedir motorun enzimatik aktivite, onlar miyozin Kullanıcı ATPaz aktivitesi bastırmak veya geliştirmek olmadığını sırasında bağlı dilate veya kısıtlı olan kalpleri neden modüle için . Bu tür ölçümler bu manikür ve yağ ile kalp tüp tüm uzunluk boyunca kalp kenarları belirlemek için genellikle mümkün değildir. Olarak (wild tip karşılaştırmak, D45 ve Mhc5 "M-mod M-modları, bozulmamış sinekler yapılmış olması değil. normal kalp çevreleyen aşağıdaki Şekil). Sağlam sinekler kalp görselleştirme diğer yaygın istihdam yöntemleri ile yapılan ölçümler genellikle kalbin en ön kısmı, konik odasına bölge sınırlıdır. Bu sabit dokusunda bu dinamik ölçüm elde etmek de mümkün değildir.
2. Hareket Algılama
Bu adım, program tarafından otomatik olarak yapılır ve her film hareketini analiz etmek için iki farklı algoritmalar kullanır. Kısaca, ilk algoritma, "Ortalama Kare Darkness" algoritması çerçeve yaklaşımı ile bir çerçeve kullanır. Bu algoritma ortalamaları bütün bir film karesi için karanlık yoğunluğu, 0 ile 1 arasında bir aralık değeri normalleştirir ve araziler zamanla filmdeki her kare için ortalama normalize. İkinci yaklaşım, "Pixel Pixel" algoritması, bir kare diğerine bireysel piksel karanlıkta değişim analiz eder. Önceden ayarlanmış bir eşiğin üzerinde yoğunluk değişiklikleri sergiler Piksel her kare için toplanır ve zamanla film her çerçeve çizilmiştir.
3. Aralıkları-Check
Iki hareket algılama algoritmaları çıktı, çıktı penceresinde "piksel piksel" üzerinde bir pencerede görüntülenen "Ortalama Darkness" çıkışı ile bu modül görüntülenir. Algılama aralıkları biz doğrudan algoritması çıkış pencereleri altında analiz edilen karelerden oluşan bir kenar izleme veya M-mod görüntüler gerçek film hareketi ile kabul emin olmak için. M-mod, dijital kalp yoluyla film her çerçeve dilim bir piksel genişliğinde kesme ve zamanla kalp kenar hareketlerin bir anlık sağlamak için yatay hizalama yapılır. Piksel piksel "pencere" olarak tanımlanan diyastolik aralıklarla bu aralık doğrudan yukarıda katkıda kare sayısı ile yatay bir yeşil çizgi ile gösterilir. Sistolik aralıklarla birbirini izleyen iki diastoles arasındaki zaman aralığı olarak tanımlanır. Dikey bir mavi çizgi ile M-mod belirtilen bir sistol başında ve sonunda dikey bir kırmızı çizgi ile gösterilir. Bu ekran sayesinde algoritma çıkışı gerçek kalp hareketleri ile aynı fikirde olmadığını görmek için nispeten kolaydır.
Hareket algılama otomatik olarak gerçekleştirilir rağmen çıkış doğruluğu kontrol edilmelidir. Bunun birkaç nedeni vardır; biri, çoğu zaman altta yatan bir kalp hareketi ile ilgili ışık düzeyleri, yavaş dalga dalgalanma olmasıdır. Bu genellikle dahili bir yüksek geçiren filtre kullanımı ile ortadan kaldırılabilir. Ikinci bir nedeni yaklaşım "piksel piksel" hassasiyeti ile ilgisi var. Bu algoritma çıktısı genellikle bir kasılma hareketi için ve gevşeme hareketleri için bir iki hareket izleri. Büyük sinekler ve bazı mutantlar süresini bu iki hareket arasında nispeten uzun olur ve program iki ayrı vuruş olarak iki hareket yorumlamaya çalışır. Bu, "Use karanlığa" kutusunu tıklatarak, Ortalama Kare Darkness algoritması ile Pixel Pixel algoritma ile çıktı karşılaştırmak için program sorarak düzeltilebilir.
Örnek (Video bakınız): 5 ila 7 hafta içinde sistolik aralıklarla genellikle genç sinekler daha uzun uçar. Bu uzun aralıklarla başlangıçta kısa bir diyastol tarafından ayrılmış iki ayrı kasılmaları olarak algılanır. Bu "Kullanım karanlık" onay kutusunu seçerek düzeltilebilir. Bu durumda program Ortalama Kare Darkness çıkışı ile Pixel Pixel algoritma ile belirlenen diyastolik aralığı karşılaştırmak gerekecektir. Ortalama Kare Darkness çıkış, pozitif bir değer varsa, daha sonra diyastolik aralığı Pixel Pixel algoritma ile belirlenen herhangi bir ihmal ve aralıklarla doğru belirtilmiş olacaktır. Tüm film, 10 saniyelik segmentlerinde taranır ve kabul edilen ("Tamam Verileri" tıklayın) veya ("Veri Çıkart" tıklayın) reddedilmiş olabilir. Hi ve Lo pass filtre hassasiyetleri Darkness algoritması istihdam daralma aralıkları tanımlamak daha doğru bir şekilde yardımcı olmak için elle ayarlanabilir.
4. Çıkış İstatistikleri
Belirli bir film için çıkış kabul edildikten sonra program otomatik olarak bir parametre sayısını hesaplamak için bu bilgileri kullanacağız. Bunlar sistolik ve diyastolik aralığı, kalp süresi ve kalp hızı, yönü ve daralma dalgası, kalp çapları ve% FS hızı. Buna ek olarak, program, üniform olmayan daralma ve gevşeme döngüsü (Fink ve ark, 2009) yansıtan arrhythmicity ölçülmesi için birden çok yöntem vardır. Istatistik çıktı ve ayrı ayrı her film için ve Microsoft Excel gibi elektronik tablo programları açılabilir virgülle ayrılmış değer (csv) dosyası şeklinde tüm veri sağlanmaktadır.
Tablo 1 -
Yarı-otomatik Optik Kalp Analizi programı tarafından oluşturulan çıktı bir örnek.
5. Güncelleme Histogramlar-
Programın bu bölümü histogram formatında bir veri kümesi için kalp aralıklarla tüm verileri görüntüler. Kalp hızları değişken olduğundan histogram çıkış verileri normalize. Ancak, dağıtım aralıkları etrafında simetrik değildir çünkü normalleşmesi için ortanca aralık değeri kullanmak demek.
Örnek (Video bakınız): KCNQ potasyum kanal için mutant Sinekler, son derece düzensiz diyastolik ve sistolik aralıklarla göstermektedir . Genellikle sistolik aralıkları çok daha uzun ve yaş eşleştirilmiş wild tip sinekler daha düzensiz. Bu açıkça (Ocorr ve ark ayrıca bkz 2007) histogram formatında verileri görüntülemek tarafından görülebilir.
6. M-mod-
Bu modül, M-modları film çerçeve içinde kalp boyunca herhangi bir pozisyonda yapılabilir üretir. M-mod uzunluğu da belirtilebilir. M-mod da kalbinde bir film yaptığını niteliksel olarak göstermek için yararlıdır.
Örnek (Video bakınız): 3 günlük eski bir M-mod oluşturmak için kullanılan ön ventrikül gösteren bir Zebra balığı larva kalp Film. Elektronik, her bir film karesinden eksize olacak piksel dikey dilim kırmızı bir çizgi ile gösterilir.
M-mod Şekil: Drosophila ve zebrafish M modları örnekleri. Hızlı kalp kısıtlama enzim kinetiği ve bazen bir iletim bloğu ile bir moleküler motor Süreç Öncesi adım sonuçları tartışılmıştır miyozin mutasyonlar biri. Her iki parametre de niteliksel M-modları kullanılarak gösterilebilir. 
Wild tip ve mutant sinekler hem de kalbin aynı kısmında yapılan M-modları açıkça MHC 5 mutant ve dilate çap ve (depresif enzim kinetiği ile miyozin ifade) D45 mutant aritmik daralma çevrimleri kısıtlı fenotip gösterebilir (modifiye Cammarato ve arkadaşları, 2008).
Ön ventrikül (aynı kalp film, gösteri, Fink ve diğerleri 2009 gösterildiği gibi) gösteren bir Zebra balığı larva kalp yapılan M-mod.
7. Red Dot Film
Bu modül, otomatik kırmızı değişen olarak tanımlanan tüm pikselleri gösteren bir analiz film yavaşlamış bir (1:4), 20 ikinci versiyonu üretir. Bu özellik, esas gösterim amaçlı kullanılır.
Film 1 - kırmızı program algoritmaları ile karanlık yoğunluğunu değiştirir olarak tanımlanır piksel gösteren bir "kırmızı nokta film". 4 faktör orijinal film hızı yavaşlamıştır.
w.jove.com/files/ftp_upload/1435/redmove.avi "> Movie 1 indirmek için buraya tıklayın.
8. Ek Uygulamalar
Biz genellikle geleneksel metodoloji kullanılarak analiz etmek zor küçük kalpleri ile diğer modelleri yüksek hızlı filmler için bu analitik sistemi uygulamaya başladı. Biz başarıyla Zebra balığı larva kalpleri ve embriyonik fare kalpleri (Fink ve ark, 2009) hem de bu analizi uyguladık.
Film 2 - Fare kalbi film artı veri çıkışı ile kontrol aralıkları ile rakam.
Movie 2 indirmek için buraya tıklayın. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila modeli embriyolojik gelişim öğrenme ve hafıza arasında değişen çeşitli bilimsel soruları gidermek için kullanılan güçlü bir genetik bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda bu çok yönlü bir model organizmanın genetik kalp fonksiyonlarının araştırmak için kullanılmaktadır. Yetişkin Drosophila kalp fizyolojisi ölçmek için bir dizi girişimi sağlam sineklerin karın manikür yoluyla yapılan gözlemlere dayanıyordu. Bu yaklaşımların çoğu, tek bir parametre, kalp hızı ölçmek için karın üzerinden iletilen ışık şiddeti değişikliklerin görsel gözlem veya kayıtları bağlıdır. Bu yararlı bir parametre olmasına rağmen kalp fonksiyonu hakkında bize ne söyler sınırlıdır. Yarı-otomatik Optik Heartbeat Analiz metodu, yüksek hızlı filmleri kalpleri atan bir dizi ek önemli parametreler hakkında doğru bilgi kaynaklanan ve bir kayıttaki her kalp atışı için bunu yapmak için sağlam bir yaklaşım.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
KO ve AC, Amerikan Kalp Birliği hibe ve bir burs tarafından desteklenmektedir. SIB ve RB NIH hibe ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MatLab software | Mathworks | Required environment for the analysis software. | |
| EM-CCD digital camera | Hamamatsu Corp. | 9100 or 9300 | Other high speed digital cameras will also work. |
| HC image data capture software | Hamamatsu Corp. | Other image capture software that produces movies in avi format will also work. | |
| Light Microscope with 10x objective | Leica Microsystems | A dipping lens that eliminates the air water interface greatly improves resolution |
References
- Cammarato, A., Dambacher, C. M., Reedy, M. C., Knowles, A. F., Kronert, W. A., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. Myosin Transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 19 (2), 553-562 (2008).
- Ocorr, K., Reeves, N., Wessells, R. J., Fink, M., Chen, H. -S. V., Akasaka, T., Yasuda, S., Metzger, J., Giles, W., Posakony, J. W., Bodmer, R. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 3943-3948 (2007).
- Fink, M., Callol-Massot, C., Chu, A., Ruiz-Lozano, P., Izpisua Belmonte, J. C., Giles, W., Bodmer, R., Ocorr, K. A new method for the detection and quantification of heartbeat parameters in Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. Biotechniques. 46, 101-113 (2009).
