RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

Summary

הבידוד של איכות גבוהה, RNA שלם הוא צעד חיוני בפרוטוקולים מעבדה רבות. הנה, אנחנו מדגימים מיצוי RNA מעוברים דג הזברה כולו סינתזה cDNA עבור יישום עוקבת הפרוצדורות השונות כולל ניתוח ביטוי גנים microarray.

Abstract

רבים הליכי מעבדה חשוב ומורכב דורשים קלט גבוהה, RNA איכות ללא פגע. מדגם מושפל או נוכחות של זיהומים יכול להוביל לתוצאות הרסניות ביישומים ניסיוני במורד הזרם. לכן, חשיבות עליונה להשתמש בטכניקות מוצק עם אמצעי הגנה רבים ושליטה בדיקות איכות כדי להבטיח מדגם מעולה. בזאת, אנחנו פרט פרוטוקול לבודד RNA סך מעוברים דג הזברה שלם באמצעות denaturant כימיים זמינים מסחרית ניקוי הבאים כדי להסיר עקבות של דנ"א זיהומים באמצעות ערכת בידוד מסחרי RNA. כאשר RNA הוא יציב יחסית ונוטים בקלות מחשוף ידי RNAses, ברוב הפרוטוקולים גן assay ביטוי בשימוש במוצר cDNA כי הוא מסונתז ישירות מתבנית RNA. אנו בפירוט הליך להמיר RNA לתוך המוצר cDNA יציבה יותר בעזרת ערכת זמינים מסחרית. במהלך הליכים אלה ישנם רבים בדיקות בקרת איכות כדי להבטיח כי המדגם הוא לא מושפל או מזוהמים. המוצר הסופי של פרוטוקולים אלה cDNA כי הוא מתאים microarray לניתוח, RT-PCR או אחסון לטווח ארוך.

Protocol

חלק 1: הפקת רנ"א סך באמצעות מגיב TRIzol

כאשר עובדים עם RNA חשוב מאוד לעבוד בסביבה ללא RNAses. אמצעי זהירות פשוטים כגון הצורך pipettes שמורות לשימוש רק עם נהלים רנ"א לרסס את אזור העבודה עם ריאגנט decontaminant (למשל, RNAse משם) לפני תחילת ההליך מועילים מאוד.

1. כדי להשיג כמות מספקת של RNA בריכה 50 עוברי דג הזברה בתוך צינור 1.5 microfuge מ"ל ולהסיר כמו מים כמה שיותר עם טפטפת.
2. מיד להוסיף 250 μl של מגיב TRIzol ¹ עד הצינור microfuge המכיל את העוברים. מגיב TRIzol מכיל פנול יש להשתמש רק מתחת למכסה המנוע קטר.
3. Lyse ו homogenize את העוברים עם העלי גלולה (כ 20 משיכות) עד רקמת מופרת מספיק.
4. כאשר תאים הומוגני מספיק, להוסיף 750 מגיב TRIzol μl שווה בנפח כולל של 1 מ"ל.
5. כדי לאפשר ניתוק מוחלט של מתחמי nucleoprotein, דגירה דגימות הומוגני במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בשלב זה, מדגם ניתן פלאש קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C או פרוטוקול יכול להיות המשך.
6. כדי להמשיך להוסיף 0.2 מ"ל של כלורופורם רוק הצינור למשך 15 שניות כדי לערבב.
7. דגירה המדגם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן בבית XG 12,000 צנטריפוגות במשך 15 דקות 4 ° C.
8. התערובת יפרידו לתוך שלב נמוך פנול, כלורופורם אדום, שלבי הביניים, ושלב צבע מימית העליון. השלב מימית העליון המכיל את הרנ"א. השכבה העליונה צריכה מהווים כ 60% בהיקף ראשוני של TRIzol (כ 0.6 מ"ל). מעבירים את השכבה העליונה מימית לתוך צינור microfuge חדשה באמצעות פיפטה 1 מ"ל נזהר שלא להעביר כל שלבי הביניים של השכבה.
9. כדי לזרז RNA להוסיף 0.5 מ"ל isopropanol.
10. אפשר המדגם לשבת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ולאחר מכן צנטריפוגות מדגם XG ב 12,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C. RNA יהוו ג'ל כמו גלולה על החלק התחתון של הצינור.
11. מבלי להפריע גלולה, להסיר את supernatant עם טפטפת לשטוף את הכדור באתנול מ"ל 1 75%. מערבבים את המדגם על ידי היפוך צנטריפוגות עדין XG ב 7500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
12. לאחר צנטריפוגה, להסיר את אתנול עם טפטפת ולאפשר מדגם להתייבש בעוד הפוכה במשך 10 דקות.
13. Resuspend את הכדור על ידי הוספת 100 μl מים RNAse-חופשית דגירה המדגם על 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מומלץ אצבע מערבולת לעתים קרובות במהלך הדגירה לסייע להחזרת נוזלים RNA. לחלופין, אתה יכול לבדוק את איכות וכמות מדגם באמצעות ND-1000 NanoDrop ספקטרופוטומטר או ישירות להמשיך לשלב הבא.

חלק 2: RNA ניקוי באמצעות RNEasy Qiagen Mini Kit

RNEasy Qiagen Mini Kit ² שימושית בהסרת מזהמים וזיהומים ממדגם RNA שבודד שיטות אחרות. עבור הליך זה, β-mercaptoethanol, אתנול, ו nuclease ללא מים נדרשים בנוסף למרכיבים כלול בערכה. טיפול אופציונלי DNAse מומלץ במהלך הליך זה.

1. עם השימוש הראשון של הערכה, הצפת הרשתית צריך להיות מוכן על ידי הוספת 4 כרכים של אתנול 100% עד נפח של 1 הרשתית חוצץ.
2. ביום של ההליך, הצפת RLT תצטרך להיות מוכן טרי. לחשב את הסכום הכולל של RLT הצפת כי יהיה צורך. נפח של 350 μl נדרשת לפי המדגם. כדי להכין מאגר RLT, הוסף 10 μl של mercaptoethanol-β של 1 מ"ל בכל המאגר. זה צריך להיעשות מתחת למכסה המנוע קטר.
3. כדי להוסיף מדגם 350 μl של RLT הצפת ו 250 μl של 100% אתנול. מערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
4. מעבירים את המדגם, אשר אמור להיות כ 700 μl, לתוך טור RNEasy אשר ממוקם צינור אוסף 2 מ"ל ו - 8000 צנטריפוגות ב XG דקה 1 בטמפרטורת החדר.
5. לאחר centrifuging, להשליך את הזרימה דרך ולהוסיף 700 μl של הצפת RW1 לעמודה ספין RNEasy.
6. צנטריפוגה מדגם XG ב 8000 דקה 1 בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למחוק את הזרימה דרך.
7. טיפול DNAse עם Qiagen RNAse ללא DNAse קיט: DNAse הטיפול הוא אופציונלי, אך מומלץ מאוד עבור דגימות באיכות הגבוהה ביותר.
   1. כאשר אתה הראשון לקבל את ערכת הטיפול DNAse, תצטרך להכין את הפתרון אני DNAse המניות על ידי הוספת מים 550 μl nuclease-חופשית DNAse. מערבבים בעדינות על ידי היפוך ואינם מערבולת. Aliquot לתוך בקבוקונים לשימוש חד המכיל 10 μl של פתרון המניות. ניתן לאחסן את הפתרון המניה ב -20 ° C עד 9 חודשים. Aliquots מופשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך 6 שבועות, אם יש צורך, אבל לא refreeze aliquots לאחר ההפשרה.
   2. כדי להכין את התערובת אני DNAse הדגירה להוסיף 70 הצפת μl RDD עד 10 μl DNAse אני sטוק פתרון לדגימה. מערבבים על ידי היפוך עדין צינור צנטריפוגות בקצרה לאסוף בצורת נוזל שיורי צידי הצינור. הוסף 80 μl לערבב DNAse אני הדגירה ישירות בעמודה ספין RNEasy. דגירה הטיפול DNAse במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
8. בעקבות טיפול DNAse להוסיף 350 RW1 הצפת μl לעמודה ספין צנטריפוגות XG ב 8000 במשך דקה 1 בטמפרטורת החדר.
9. לאחר צנטריפוגה להתעלמות לזרום ולהוסיף 500 הרשתית הצפת μl לעמודה ספין. דגירה מדגם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
10. צנטריפוגה מדגם XG ב 8000 דקה 1 בטמפרטורת החדר וזורקים את הזרימה דרך.
11. לאחר צנטריפוגה להוסיף 500 אתנול 75% μl לעמודה ספין.
12. חזור צנטריפוגה XG ב 8000, אבל 2 דקות בטמפרטורת החדר.
13. לאחר צנטריפוגה להתעלמות לזרום ולאפשר בעמודה להתייבש במשך 5 דקות.
14. מיד צנטריפוגות XG ב 8000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר כל שנשאר עקבות של אתנול.
15. לאחר צנטריפוגה היא להעביר להשלים את הטור ספין לתוך צינור האוסף החדש 1.5 מ"ל ולהוסיף מים 10 μl nuclease חינם. דגירה דקה 1 ואז צנטריפוגות ב XG 10,000 דקה 1 בטמפרטורת החדר. RNA יהיה בזרימה דרך.
16. הוסף 10 μl מים nuclease ללא לעמודה ספין דגירה בטמפרטורת החדר למשך דקה 1. צנטריפוגה מדגם XG ב 10,000 דקה 1 בטמפרטורת החדר.
17. לאחר צנטריפוגה להסיר ולסלק את העמודה ספין. RNA תהיה זרימה דרך.
18. בדוק את הכמות והאיכות של ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000 בעקבות הוראות היצרן.
19. בנוסף, מפעיל או להשתמש בג'ל denaturing 2100 Agilent bioanalyzer כדי לבדוק את תקינות של רנ"א.
20. דוגמאות יש לאחסן ב -80 ° C עד סינתזה cDNA יכול להתבצע.

חלק 3: סינתזה cDNA באמצעות עילי Invitrogen ראשון סטרנד מערכת

RNA הוא נוטה בקלות מחשוף ידי RNAses המוביל השפלה. כתוצאה מכך רבים ביטוי גן פרוטוקולים פותחו כדי להשתמש במוצר cDNA יציב יותר, כי כבר מסונתז ישירות RNA. כאן אנו פרט סינתזה של גדיל הראשונה cDNA באמצעות עילי Invitrogen ראשון סטרנד מערכת סינתזה ^3. כל תגובה סינתזה cDNA יכול להכיל עד 5 מיקרוגרם של רנ"א.

1. לפני תחילת לערבב ההליך בקצרה צנטריפוגות כל רכיב.
2. הכן RNA / תערובת פריימר על צינור מ"ל סטרילי 0.5 microfuge כפי שמתואר בטבלה 1.
3. דגירה המדגם על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
4. מיד להעביר מדגם slurry קרח במשך 10 דקות.
5. אמנם המדגם הוא קירור להכין תערובת הורים עם הרכיבים המפורטים בטבלה 2. כרכים מפורטים לכל תגובה 1. התאמת כמויות בהתאם למספר הכולל של התגובות.
6. לאחר קירור, להוסיף 9 μl של תמהיל מאסטר מוכן בשלב 5 לכל RNA / תערובת פריימר. מערבבים בעדינות על ידי צנטריפוגה ולאסוף קצר. הנפח הכולל של כל דגימה צריכה להיות 19 μl.
7. דגירה מדגם ב 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות thermocycler.
8. הוסף μl 1 (50 יחידות) של עילי II RT על צינור אחד, לערבב לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות thermocycler.
9. לסיים את התגובה על 70 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולאחר מכן מדגם צמרמורת 4 ° C. Thermocycler ניתן לתכנת עבור שלבים 8 ו 9.
10. אחרי המדגם הגיע 4 ° C, להעביר את התגובה באמבט קרח.
11. על קרח להוסיף 1 μl של RNAse H כדי צינור כל דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורה 37 ° C. ההיקף הכולל כיום 21 μl. תוספת של RNAse H המדגם שלך יהיה לבזות את התבנית RNA ולהשאיר רק את המוצר גדיל בודד cDNA.

חלק 4: בידוד רטיבות cDNA ו

1. 1.5 שלב מ"ל לנעול שפופרת הג'ל ישמשו הבידוד של המוצר cDNA. הכן 1.5 מ"ל שלב הנעילה שפופרת הג'ל על ידי צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 2 דקות. הג'ל צריכים להיות בחלק התחתון של הצינור.
2. הוסף μl 81.5 פנול (טריס רווי, שנאגרו ל-pH 8.0), 81.5 μl של אלכוהול 24:1 isoamyl כלורופורם, ואת המדגם (21 μl) לתוך צינור נעילת שלב ג'ל. מערבבים כמה פעמים על ידי היפוך עדין.
3. צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. CDNA צריך להיות בשלב מימית העליון. מעבירים את השלב העליון לתוך צינור נקי מ"ל 1.5 microfuge. ההיקף הכולל צריך להיות סביב 20 μl.
5. הוסף 1X נפח של 3 M NaOAc, pH 5.2 ומערבבים בעדינות. לדוגמה, אם נפח של השלב מימית העליון היה שווה μl 20, תצטרך להוסיף 2 μl של 3 M NaOAc, pH 5.2.
6. הוסף 7 μl של גליקוגן מ"ג / 5 מ"ל ומערבבים בעדינות.
7. הוסף 1X נפח isopropanol ומערבבים בעדינות. בדרך כלל זה הוא סביב 30 μl של isopropanol.
8. אפשר המדגם כדי לדגור על temperatur חדרדואר במשך 10 דקות ואז ב XG 12,000 צנטריפוגות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
9. גלולה קטנה cDNA צריך טופס על החלק התחתון של הצינור. הסר בזהירות את supernatant עם טפטפת.
10. הוסף 500 μl של אתנול 70% ומערבבים על ידי היפוך.
11. צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 5 דקות.
12. לאחר צנטריפוגה להסיר את supernatant עם טפטפת וחזור על לשטוף אתנול 70% ו צנטריפוגה (שלבים 10 ו 11).
13. לאחר צנטריפוגה להסיר את supernatant עם טפטפת. אם יש נוזלים הנותרים על צדי הצינור, זה יכול להיות שנאספו על ידי ספינינג בקצרה את הצינורית. הסר את כל נוזל עודף ולאפשר גלולה להתייבש בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
14. הוסף 20 μl מים nuclease-חופשית רעננותם גלולה. מניחים את המדגם ב 55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות על התייבשות של גלולה.
15. הכמות והאיכות של המוצר cDNA מסומן מכן באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop ND-1000 בעקבות הוראות היצרן. CDNA יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C.

נציג תוצאות

לאחר ניקוי RNA, כ -15 מיקרוגרם של רנ"א הכל באיכות גבוהה ניתן לצפות מ 50 עוברי דג הזברה. כדי להעריך את האיכות הכוללת RNA, ספקטרופוטומטר, ג'ל אלקטרופורזה, וכן 2100 Agilent Bioanalyzer ניתן להשתמש. ND-1000 NanoDrop ספקטרופוטומטר ניתן להשתמש כדי להעריך את ספיגת ב 260 ננומטר לעומת ספיגת ב 280 ננומטר (איור 1). ₂₆₀ / ₂₈₀ יחס יכול לגלות את נוכחותם של מזהמים ולתת עדות של השפלה אפשרית. ₂₆₀ / ₂₈₀ יחס של 1.9-2.0 נחשב מקובל. בנוסף, מומלץ מאוד כי ג'ל denaturation RNA להפעיל כדי להעריך את היושרה RNA. גדילי RNA יפרידו על בסיס הגודל שלהם, עם קווצות קטנות נודדות בהמשך הג'ל. מדגם לא מושפל יופיעו למרוח עם שתי להקות חזק. למרוח היא תוצאה של אוכלוסייה שונים גדילי ה-mRNA בגודל להקות מתאימות -28 ו 18S rRNA. להקת -28 צריך להיות בערך פעמיים אינטנסיבי כמו הלהקה 18S (איור 2). לחלופין, הכולל שלמות RNA ניתן להעריך באמצעות bioanalyzer 2100 Agilent. שתי פסגות נפרדות המייצגות את ו -28 18S rRNA צפוי (איור 3). השיא -28 צריך להיות גדול יותר 18S שיא עם האזור תחת הפסגות כ 2:01, בהתאמה. שני שיאים ברורים לא יהיה נצפתה בדגימות מושפל. דגימות רנ"א מציג השפלה לא צריך להתבצע באמצעות הפרוצדורות הבאות.

ניתוח Spectrophotometric ניתן להשתמש כדי להעריך את איכות המוצר cDNA (איור 4). ₂₆₀ / ₂₈₀ צריך להיות סביב 1.8. תגובות cDNA עם קלט של 5 מיקרוגרם של רנ"א הכל שגרתי תשואה 1-2 מיקרוגרם של המוצר cDNA במעבדה שלנו.

באיור 1. ספקטרום NanoDrop מדגם RNA. לאחר ניקוי RNA, RNA כמות ואיכות ניתן להעריך באמצעות ND-1000 NanoDrop ספקטרופוטומטר. כ -15 מיקרוגרם של איכות גבוהה הכולל RNA הוא הניב שגרתי של 50 עוברי דג הזברה עם יחס ₂₆₀ / ₂₈₀ סביב 1.9-2.0.

איור 2. ג'ל denaturation RNA. על מנת להעריך את שלמות הבידוד RNA הכולל, ג'ל denaturation RNA יכול להיות רץ. למרוח עם שתי להקות בהיר המקביל ו -28 18S rRNA צפוי. להקת -28 צריכה להיות בערך פי שניים אינטנסיבי כלהקה 18S.

איור 3. שמץ של מדגם RNA מתוך bioanalyzer. על מנת להעריך את שלמות הבידוד RNA הכולל, דגימות עשוי גם להיות מנותח על 2100 Agilent bioanalyzer. שתי פסגות חדות, המקביל ל -28 ו rRNA 18S, צריך להיות גלוי. השיא -28 צריך להיות גדול יותר 18S שיא עם האזור תחת הפסגות כ 2:01, בהתאמה.

איור 4. ספקטרום NanoDrop מדגם cDNA. ניתוח Spectrophotometric עם NanoDrop ND-1000 ניתן להשתמש כדי להעריך את כמות ואיכות המוצר cDNA. ₂₆₀ / ₂₈₀ יחס צריך להיות סביב 1.8. תגובות cDNA עם קלט של UG 5 של רנ"א סך שגרתי תשואה 1-2 UG של cDNA במעבדה שלנו.

טבלה 1. רכיבי להוסיף עבור RNA / תערובות תחל בשלב 2 של סינתזה cDNA.

רכיב	נפח
סך RNA (עד 5 מיקרוגרם)	10 μl
10 mM לערבב dNTP	1 μl
אוליגו (DT) 12-18 (0.5 מיקרוגרם / μl)	1 μl
DEPC שטופלו מים	n μl
סך נפח	10 μl

2. טבלה התגובה תערובת עבור לשלב 5 של סינתזה cDNA. כרכים המפורטים הם לכל תגובה. הגדלת נפח של כל רכיב עבור המספר הכולל של התגובות.

רכיב	נפח
מאגר 10X RT	2 μl
25 מ"מ MgCl2	4 μl
0.1 מ"מ DTT	2 μl
RNAseOUT	1 μl

Discussion

השבריריות של מולקולת רנ"א הוא השיקול הקריטי ביותר, כי יש לזכור לאורך כל פרוטוקול זה. ציוד סטרילי כי הוא RNAse ללא יש להשתמש תמיד באזור RNAse חינם של המעבדה. זה עוזר לשמור חלק במעבדה לשמש הליכים RNA בלבד. אזור זה צריך להיות מרוסס לעיתים קרובות עם מוצר RNAse הסרת, כגון RNAse Away. דגימות רנ"א צריך תמיד להיות מטופלים עם כפפות כל הזמן על הקרח כדי למנוע השפלה.

פרוטוקול זה ניצלו ריאגנטים וערכות זמינים מסחרית. לחלופין, ישנם חומרים כימיים נוספים רבים ערכות RNA בידוד הקיימים בשוק עבור סכום isolations RNA. ריאגנטים וערכות נכלל בפרוטוקול זה עובד היטב באופן שגרתי הניב RNA באיכות גבוהה במעבדה שלנו.

כחלופה, כפול סינתזה cDNA תקועים יכול להתבצע, במקום לסינתזה גדיל הדגים לראשונה בפרוטוקול זה. CDNA תקועים פעמיים הוא הרצוי לפעמים כפי שהוא מספק יציבות מוגברת. בנוסף, פרוטוקולים מסוימים דורשים מוצרים cDNA גדילי כפול כקלט. עם זאת, אם דגימות הולכים להיות כל הזמן בבית ליישומים במורד הזרם, סינתזת הגדיל הראשון הוא מספיק הוא הרבה יותר חסכוני.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026