Biology

भ्रूणीय Zebrafish और सीडीएनए संश्लेषण से जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण के लिए शाही सेना अलगाव

Published: August 7, 2009 doi: 10.3791/1470

Samuel M. Peterson¹, Jennifer L. Freeman¹

¹School of Health Sciences, Purdue University

Summary

उच्च गुणवत्ता के अलगाव, शाही सेना बरकरार कई प्रयोगशाला प्रोटोकॉल में एक आवश्यक कदम है. यहाँ, हम पूरे zebrafish भ्रूण और बाद में जीन की अभिव्यक्ति माइक्रोएरे विश्लेषण सहित विभिन्न प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में आवेदन के लिए सीडीएनए संश्लेषण से शाही सेना निकासी प्रदर्शित करता है.

Abstract

कई महत्वपूर्ण और जटिल प्रयोगशाला प्रक्रिया उच्च गुणवत्ता बरकरार शाही सेना के एक इनपुट की आवश्यकता है. एक अपमानित नमूना या अशुद्धियों की उपस्थिति बहाव प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों में विनाशकारी परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए यह अत्यंत महत्व के कई रक्षोपायों और गुणवत्ता नियंत्रण की जाँच के साथ ठोस तकनीक का उपयोग करने के लिए एक बेहतर नमूना सुनिश्चित है. इस के साथ साथ, हम विस्तार करने के लिए एक पूरे zebrafish भ्रूण से एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रासायनिक denaturant और बाद में सफाई का उपयोग करने के लिए डीएनए और दोष एक वाणिज्यिक आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर के निशान हटाने कुल शाही सेना को अलग प्रोटोकॉल. के रूप में शाही सेना अपेक्षाकृत अस्थिर है और आसानी से RNAses द्वारा दरार करने के लिए प्रवण है, सबसे प्रोटोकॉल परख जीन अभिव्यक्ति का उपयोग कर एक सीडीएनए उत्पाद है कि सीधे एक शाही सेना टेम्पलेट से संश्लेषित है. हम एक प्रक्रिया विस्तार आरएनए अधिक स्थिर सीडीएनए उत्पाद में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर कन्वर्ट. इन प्रक्रियाओं के दौरान वहाँ कई गुणवत्ता नियंत्रण चेक करने के लिए सुनिश्चित करें कि नमूना अपमानित या दूषित नहीं है. इन प्रोटोकॉल के अंत उत्पाद सीडीएनए कि माइक्रोएरे विश्लेषण, RT-पीसीआर या लंबी अवधि के भंडारण के लिए उपयुक्त है.

Protocol

भाग 1: कुल शाही सेना के निष्कर्षण TRIzol अभिकर्मक का उपयोग

जब शाही सेना के साथ काम कर रहे यह बहुत महत्वपूर्ण है के लिए एक वातावरण है कि RNAses से मुक्त है में काम. शाही सेना प्रक्रियाओं के साथ केवल उपयोग के लिए आरक्षित pipettes होने और प्रक्रिया की शुरुआत से पहले एक decontaminant अभिकर्मक (जैसे, दूर RNase) के साथ कार्य क्षेत्र छिड़काव के रूप में सरल सावधानियों बहुत मददगार रहे हैं.

एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में शाही सेना पूल 50 zebrafish भ्रूण की एक पर्याप्त राशि प्राप्त करने और संभव के रूप में ज्यादा पानी के रूप में एक विंदुक के साथ दूर.
तत्काल microfuge ट्यूब युक्त भ्रूण TRIzol ¹ अभिकर्मक के 250 μl जोड़ें. TRIzol अभिकर्मक phenol होते हैं और केवल एक धूआं हुड के तहत इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
Lyse और एक गोली मूसल (लगभग 20 स्ट्रोक) के साथ भ्रूण homogenize जब तक ऊतक पर्याप्त बाधित है.
जब कोशिकाओं को पर्याप्त homogenized हैं, 750 μl TRIzol अभिकर्मक जोड़ने के लिए 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा के बराबर है.
Nucleoprotein परिसरों का पूरा पृथक्करण की अनुमति के लिए, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए homogenized नमूने सेते हैं. इस स्तर पर, नमूना फ़्लैश तरल नाइट्रोजन में जमे हुए और में -80 डिग्री सेल्सियस या प्रोटोकॉल जारी किया जा सकता है संग्रहित किया जा सकता है.
क्लोरोफॉर्म की 0.2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए जारी है और 15 सेकंड के लिए मिश्रण लिए ट्यूब रॉक.
कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सेते हैं नमूना और फिर 4 बजे 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
मिश्रण एक कम चरण लाल phenol के क्लोरोफॉर्म interphase, और एक बेरंग ऊपरी जलीय चरण में अलग कर देगा. ऊपरी जलीय चरण शाही सेना में शामिल है. ऊपर परत TRIzol के प्रारंभिक मात्रा (लगभग 0.6 मिलीलीटर) के बारे में 60% का समावेश होना चाहिए. एक नया microfuge एक 1 मिलीलीटर सावधान किया जा रहा पिपेट का उपयोग interphase परत के किसी भी स्थानांतरण नहीं ट्यूब में शीर्ष जलीय परत स्थानांतरण.
करने के लिए वेग आरएनए 0.5 मिलीलीटर isopropanol जोड़ने.
नमूना 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए और फिर 12,000 XG पर 10 मिनट के लिए 4 में नमूना अपकेंद्रित्र अनुमति दें डिग्री सेल्सियस शाही सेना ट्यूब के तल पर एक जेल की तरह गोली फार्म का होगा.
गोली परेशान करने के बिना, एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटाने और 1 मिलीलीटर 75% इथेनॉल में गोली धोने. कोमल और 7500 XG पर उलटा अपकेंद्रित्र से 5 मिनट के लिए मिश्रण 4 में नमूना डिग्री सेल्सियस
Centrifugation के बाद, एक विंदुक के साथ इथेनॉल हटाने और नमूना है, जबकि 10 मिनट के लिए उल्टे सूखी अनुमति देते हैं.
RNase मुफ्त पानी के 100 μl जोड़कर गोली Resuspend और 55 में नमूना सेते ° C 10 मिनट के लिए. यह भंवर आरएनए पुनर्जलीकरण में सहायता करने के लिए ऊष्मायन के दौरान अक्सर उंगली की सिफारिश की है. वैकल्पिक रूप से, आप नमूना गुणवत्ता और मात्रा के एक NanoDrop ND-1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर की जाँच करें या सीधे अगले कदम के लिए जारी कर सकते हैं.

भाग 2: शाही सेना Qiagen RNEasy मिनी किट का उपयोग कर सफाई

Qiagen RNEasy मिनी किट ² अन्य तरीकों से अलग एक शाही सेना नमूना से contaminants और अशुद्धियों को दूर करने में उपयोगी है. इस प्रक्रिया के लिए, β-mercaptoethanol, इथेनॉल, और nuclease मुफ्त पानी किट में शामिल घटकों के अलावा की जरूरत है. इस प्रक्रिया के दौरान एक वैकल्पिक DNase उपचार की सिफारिश की है.

किट के पहले उपयोग पर, RPE बफर बफर RPE का 1 मात्रा के लिए 100% इथेनॉल 4 मात्रा को जोड़कर तैयार किया जा आवश्यकता होगी.
प्रक्रिया के दिन, बफर RLT ताजा तैयार किया जा आवश्यकता होगी. बफर RLT की कुल राशि है कि जरूरत होगी गणना. नमूना प्रति 350 μl का एक मात्रा की जरूरत है. बफर RLT तैयार करने के लिए, बफर के हर 1 मिलीलीटर के लिए β-mercaptoethanol के 10 μl जोड़ने. यह धूआं हुड के नीचे किया जाना चाहिए.
प्रत्येक नमूना बफर RLT 350 μl और 100% इथेनॉल 250 μl जोड़ें. Pipetting और नीचे कई बार अच्छी तरह मिक्स.
नमूना है, जो लगभग 700 μl है कि एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब और अपकेंद्रित्र में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 8,000 XG पर रखा गया है एक RNEasy स्तंभ में होना चाहिए, स्थानांतरण.
Centrifuging के बाद, के माध्यम से प्रवाह त्यागें और एक RNEasy स्पिन स्तंभ RW1 बफर के 700 μl जोड़ने.
कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 8,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र और फिर के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
Qiagen RNase मुफ्त DNase किट के साथ DNase उपचार: DNase उपचार वैकल्पिक है, लेकिन अत्यधिक उच्चतम गुणवत्ता के नमूने के लिए सिफारिश की है.
1. जब आप पहली बार DNase उपचार किट प्राप्त करने के लिए, आप DNase 550 μl nuclease मुक्त पानी जोड़कर DNase मैं शेयर समाधान तैयार करने की जरूरत होगी. Inverting द्वारा धीरे मिक्स और भंवर नहीं. एकल उपयोग स्टॉक समाधान के 10 μl युक्त शीशियों में विभाज्य. -20 डिग्री सेल्सियस पर 9 महीने के लिए स्टॉक समाधान स्टोर कर सकते हैं. thawed aliquots 4 डिग्री सेल्सियस 6 सप्ताह के लिए अगर जरूरत पर भंडारित किया जा सकता है, लेकिन विगलन के बाद aliquots refreeze करते नहीं.
2. DNase मैं ऊष्मायन मिश्रण करने के लिए तैयार 70 μl 10 μl DNase मैं RDD बफर जोड़नेनमूना प्रति tock समाधान. कोमल उलटा और अपकेंद्रित्र ट्यूब द्वारा मिक्स संक्षिप्त अवशिष्ट तरल रूप ट्यूब के पक्ष इकट्ठा करने के लिए. सीधे RNEasy स्पिन स्तंभ से 80 μl DNase मैं ऊष्मायन मिश्रण जोड़ें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए DNase उपचार सेते हैं.
निम्नलिखित DNase उपचार स्पिन और कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 8,000 XG पर स्तंभ अपकेंद्रित्र 350 μl बफर RW1 जोड़ें.
बाद centrifugation के माध्यम से प्रवाह त्यागें और स्पिन स्तंभ के लिए 500 μl बफर RPE जोड़ने. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूना सेते हैं.
कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 8,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र और के माध्यम से प्रवाह त्यागें.
Centrifugation के बाद स्पिन स्तंभ के लिए 500 μl 75% इथेनॉल जोड़ें.
8000 XG पर centrifugation दोहराएँ, लेकिन कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए.
बाद centrifugation के माध्यम से प्रवाह त्यागें और स्तंभ 5 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति.
तुरंत +८००० XG पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इथेनॉल के निशान से अधिक किसी भी बाईं हटायें अपकेंद्रित्र.
Centrifugation पूरा हस्तांतरण के बाद स्पिन स्तंभ है और एक नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में 10 μl nuclease मुक्त पानी जोड़ने. 1 मिनट के लिए सेते हैं और फिर कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर अपकेंद्रित्र. शाही सेना के माध्यम से किया जाएगा प्रवाह में.
स्पिन स्तंभ nuclease मुक्त पानी की एक और 10 μl जोड़ें और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 10,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
Centrifugation बाद हटाने और स्पिन स्तंभ त्यागें. शाही सेना के प्रवाह में के माध्यम से किया जाएगा.
मात्रा और शाही सेना की गुणवत्ता के निर्माता के निर्देशों का पालन एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ND-1000 का उपयोग की जाँच करें.
इसके अलावा, एक denaturing जेल चलाने या एक Agilent के bioanalyzer 2100 उपयोग करने के लिए शाही सेना की अखंडता की जाँच करें.
नमूने -80 में संग्रहित किया जाना चाहिए ° सी जब तक सीडीएनए संश्लेषण किया जा सकता है.

भाग 3: सीडीएनए संश्लेषण Invitrogen सुपरस्क्रिप्ट पहली Strand सिस्टम का उपयोग

शाही सेना आसानी से गिरावट के लिए अग्रणी RNAses द्वारा दरार करने के लिए प्रवण है. एक परिणाम के रूप में कई जीन अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल के लिए एक अधिक स्थिर सीडीएनए उत्पाद है कि सीधे शाही सेना से संश्लेषित किया गया है का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है. यहाँ हम पहली भूग्रस्त Invitrogen सुपरस्क्रिप्ट संश्लेषण पहले Strand ³ प्रणाली का उपयोग सीडीएनए के विस्तार संश्लेषण . प्रत्येक सीडीएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया शाही सेना के 5 μg को समायोजित कर सकते हैं.

प्रक्रिया मिश्रण शुरू करने से पहले और संक्षेप में प्रत्येक घटक अपकेंद्रित्र.
एक बाँझ 0.5 मिलीलीटर microfuge तालिका 1 में उल्लिखित के रूप में ट्यूब में शाही सेना / प्राइमर मिश्रण तैयार करें.
65 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए पर नमूना सेते हैं.
तुरंत 10 मिनट के लिए बर्फ गारा नमूना हस्तांतरण.
जबकि नमूना तालिका 2 में उल्लिखित घटकों के साथ एक मास्टर मिश्रण तैयार ठंडा है. मात्रा प्रति एक प्रतिक्रिया सूचीबद्ध हैं. प्रतिक्रियाओं की कुल संख्या के लिए मात्रा तदनुसार समायोजित करें.
ठंडा करने के बाद, गुरु चरण 5 में प्रत्येक आरएनए / प्राइमर मिश्रण करने के लिए तैयार मिश्रण के 9 μl जोड़ें. धीरे मिक्स और संक्षिप्त centrifugation द्वारा इकट्ठा. प्रत्येक नमूने की कुल मात्रा 19 μl होना चाहिए.
42 ° सी में एक thermocycler में 2 मिनट के लिए नमूना सेते हैं.
प्रत्येक ट्यूब 1 सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय आरटी के μl (50 इकाइयों) जोड़ें, मिश्रण, और 42 पर सेते ° सी thermocycler में 60 मिनट के लिए.
70 पर प्रतिक्रिया बर्खास्त ° सी 15 मिनट के लिए और फिर डिग्री सेल्सियस 4 के लिए ठंडा नमूना एक thermocycler चरण 8 और 9 के लिए क्रमादेशित किया जा सकता है.
बाद नमूना 4 ° सेल्सियस तक पहुँच गया है, एक बर्फ स्नान करने के लिए प्रतिक्रिया हस्तांतरण.
बर्फ में प्रत्येक ट्यूब RNase एच 1 μl जोड़ने और 37 पर 20 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस अब कुल मात्रा 21 μl है. RNase एच के अपने नमूना के अलावा शाही सेना टेम्पलेट नीचा और केवल एकल भूग्रस्त सीडीएनए उत्पाद छोड़ देंगे.

भाग 4: सीडीएनए अलगाव और वर्षा

एक 1.5 मिलीलीटर चरण ताला जेल ट्यूब सीडीएनए उत्पाद के अलगाव में उपयोग किया जाएगा. 2 मिनट के लिए 12,000 XG पर centrifugation द्वारा एक 1.5 मिलीलीटर चरण लॉक जेल ट्यूब तैयार करें. जेल ट्यूब के नीचे होना चाहिए.
चरण ताला जेल ट्यूब में μl 81.5 (Tris - संतृप्त, 8.0 पीएच के लिए बफर) phenol, 24:1 क्लोरोफॉर्म isoamyl शराब की 81.5 μl, और नमूना (21 μl) जोड़ें. कोमल उलटा द्वारा कई बार मिक्स.
12,000 XG पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र.
सीडीएनए ऊपरी जलीय चरण में होना चाहिए. एक साफ 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में ऊपरी चरण स्थानांतरण. कुल मात्रा 20 μl के आसपास होना चाहिए.
एम 3 NaOAc, पीएच 5.2 1X मात्रा जोड़ें और धीरे मिश्रण. उदाहरण के लिए, अगर ऊपरी जलीय चरण की मात्रा 20 μl के बराबर था, आप एम 3 NaOAc, पीएच 5.2 के 2 μl जोड़ने की आवश्यकता होगी.
5 ग्लाइकोजन मिलीग्राम / एमएल के 7 μl जोड़ें और धीरे मिश्रण.
Isopropanol के 1X मात्रा जोड़ें और धीरे मिश्रण. आम तौर पर इस के आसपास isopropanol के 30 μl है.
नमूना कमरे temperatur में सेते करने की अनुमति दें10 मिनट के लिए ई और फिर 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र.
एक छोटे सीडीएनए गोली ट्यूब के तल पर फार्म चाहिए. ध्यान से एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
70% इथेनॉल और उलटा द्वारा मिश्रण के 500 μl जोड़ें.
5 मिनट के लिए 12,000 XG पर नमूना अपकेंद्रित्र.
बाद centrifugation एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटाने और 70% इथेनॉल धोने और centrifugation (10 और 11 चरणों) दोहराएँ.
Centrifugation के बाद एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें. यदि ट्यूब के पक्षों पर शेष तरल है, यह संक्षिप्त ट्यूब कताई द्वारा इकट्ठा किया जा सकता है. किसी भी अतिरिक्त तरल निकालें और गोली कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति देते हैं.
गोली rehydrate nuclease मुफ्त पानी के 20 μl जोड़ें. गोली के पुनर्जलीकरण के लिए 5 मिनट के लिए 55 ° सी में नमूना रखें.
सीडीएनए उत्पाद की मात्रा और गुणवत्ता तो निर्माता के निर्देशों का पालन करने के लिए एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ND-1000 का उपयोग कर जाँच की है. सीडीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है

प्रतिनिधि परिणाम

शाही सेना के सफाई के बाद, उच्च गुणवत्ता वाले कुल शाही सेना के लगभग 15 μg 50 zebrafish भ्रूण से उम्मीद की जा सकती है. कुल शाही सेना गुणवत्ता, स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, जेल वैद्युतकणसंचलन, और एक Agilent Bioanalyzer 2100 का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक NanoDrop ND-1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 260 एनएम पर 280 एनएम (चित्रा 1) पर absorbance की तुलना में absorbance के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ₂₆₀ / ₂₈₀ अनुपात contaminants की उपस्थिति का पता चलता है और संभव गिरावट के सबूत दे सकते हैं . एक एक ₂₆₀ / 1.9-2.0 के ₂₈₀ अनुपात स्वीकार्य माना जाता है. इसके अलावा, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि एक शाही सेना विकृतीकरण जेल आरएनए अखंडता का आकलन करने के लिए चलाए जा. शाही सेना किस्में उनके आकार के आधार पर छोटे strands जेल नीचे आगे पलायन के साथ अलग कर देगा. गैर अपमानित नमूना दो मजबूत बैंड के साथ एक धब्बा के रूप में दिखाई देगा. स्मियर अलग आकार mRNA किस्में के एक जनसंख्या का एक परिणाम है और बैंड 28S और 18s rRNA के अनुरूप है. 28S बैंड के बारे में दो बार के रूप में 18s बैंड (चित्रा 2) के रूप में तीव्र होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, कुल शाही सेना अखंडता एक Agilent bioanalyzer 2100 का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. दो अलग चोटियों का प्रतिनिधित्व 28S और 18s rRNA (चित्रा 3) की उम्मीद है. 28S चोटी चोटियों के तहत क्षेत्र के साथ चोटी 18s 2:01 लगभग क्रमशः, की तुलना में बड़ा होना चाहिए. दो अलग चोटियों अपमानित नमूनों में नहीं मनाया जाएगा. आरएनए गिरावट प्रदर्शन नमूने बाद में प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के माध्यम से नहीं किया जाना चाहिए.

Spectrophotometric विश्लेषण करने के लिए (चित्रा 4) सीडीएनए उत्पाद की गुणवत्ता का आकलन किया जा सकता है. ₂₆₀ / ₂₈₀ ए 1.8 के आसपास होना चाहिए. कुल शाही सेना के 5 μg के एक इनपुट के साथ सीडीएनए प्रतिक्रियाओं नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में सीडीएनए उत्पाद के 1-2 μg उपज.

चित्रा 1. शाही सेना के नमूने के एक NanoDrop स्पेक्ट्रम. आरएनए सफाई के बाद, शाही सेना मात्रा और गुणवत्ता के एक NanoDrop ND-1000 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है. उच्च गुणवत्ता वाले कुल शाही सेना के लगभग 15 μg नियमित रूप से _एक ए 260 / 1.9-2.0 _के आसपास 280 अनुपात के साथ 50 zebrafish भ्रूण से मिले है.

चित्रा 2. एक शाही सेना विकृतीकरण जेल कुल शाही सेना अलगाव की अखंडता का आकलन करने के लिए, एक शाही सेना विकृतीकरण जेल भागा जा सकता है. दो उज्ज्वल 28S और 18s rRNA इसी बैंड के साथ एक धब्बा की उम्मीद है. 28S बैंड लगभग 18s बैंड के रूप में तीव्र के रूप में दो बार होना चाहिए.

चित्रा 3. एक शाही सेना के नमूने के एक ट्रेस bioanalyzer से. कुल शाही सेना अलगाव की अखंडता का आकलन करने के लिए, नमूने भी एक Agilent के इक्कीस सौ bioanalyzer पर विश्लेषण किया जा सकता है. दो तेज चोटियों, 28S और 18s rRNA इसी दिखाई जानी चाहिए. 28S चोटी चोटियों के तहत क्षेत्र के साथ चोटी 18s 2:01 लगभग क्रमशः, की तुलना में बड़ा होना चाहिए.

चित्रा 4. एक सीडीएनए नमूने के एक NanoDrop स्पेक्ट्रम एक NanoDrop ND-1000 के साथ Spectrophotometric विश्लेषण सीडीएनए उत्पाद की मात्रा और गुणवत्ता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ₂₆₀ / ₂₈₀ अनुपात 1.8 के आसपास होना चाहिए. कुल शाही सेना के 5 स्नातकीय के एक इनपुट के साथ सीडीएनए प्रतिक्रियाओं नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में सीडीएनए के 1-2 स्नातकीय उपज.

तालिका 1. अवयव सीडीएनए संश्लेषण के चरण 2 में शाही सेना प्राइमर / मिश्रण के लिए जोड़ने के लिए.

घटक	आयतन
कुल शाही सेना (5 μg)	10 μl
10 मिमी dNTP मिश्रण	1 μl
(डीटी) oligo 12-18 (0.5 μg / μl)	1 μl
DEPC - इलाज पानी	पता μl
कुल मात्रा	10 μl

टेबल 2. सीडीएनए संश्लेषण के 5 कदम के लिए रिएक्शन मिश्रण . सूचीबद्ध खंड की प्रतिक्रिया के प्रति हैं. प्रतिक्रियाओं की कुल संख्या के लिए प्रत्येक घटक की मात्रा बढ़ाएँ.

घटक	आयतन
10X आरटी बफर	2 μl
25 MgCl2 मिमी	4 μl
0.1 मिमी डीटीटी	2 μl
RNAseOUT	1 μl

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Discussion

शाही सेना अणु की कमजोरी सबसे महत्वपूर्ण विचार है कि इस प्रोटोकॉल भर में याद किया जाना चाहिए है. बाँझ उपकरण है कि RNase मुक्त है हमेशा प्रयोगशाला के एक RNase मुक्त क्षेत्र में किया जाना चाहिए. यह केवल शाही सेना प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा प्रयोगशाला का एक हिस्सा आरक्षित करने के लिए उपयोगी है. इस क्षेत्र में अक्सर RNase जैसे एक RNase हटाने उत्पाद है, दूर के साथ छिड़काव किया जाना चाहिए. शाही सेना के नमूने हमेशा दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए और बर्फ पर रखा गिरावट को रोकने.

इस प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और किट का लाभ लिया. वैकल्पिक रूप से, वहाँ कई अतिरिक्त अभिकर्मकों और आरएनए अलगाव किट कुल शाही सेना isolations के लिए बाजार पर उपलब्ध हैं. अभिकर्मकों और किट इस प्रोटोकॉल में शामिल अच्छी तरह से काम किया है और नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला में उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए झुकेंगे.

एक विकल्प के रूप में, डबल असहाय सीडीएनए संश्लेषण पहली कतरा इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन संश्लेषण के बजाय, प्रदर्शन कर सकते हैं. कभी कभी डबल असहाय सीडीएनए के रूप में यह वृद्धि की स्थिरता प्रदान करता है वांछित है. इसके अलावा, कुछ प्रोटोकॉल एक इनपुट के रूप में डबल असहाय सीडीएनए उत्पादों की आवश्यकता होती है. हालांकि, अगर नमूने बहाव के अनुप्रयोगों के लिए घर में रखा होने जा रहे हैं, पहले कतरा संश्लेषण पर्याप्त है और अधिक किफायती है.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026