RNA Isolering från embryonala Zebrafish och cDNA syntes för Gene Expression Analysis

Summary

Isolering av hög kvalitet, är intakt RNA ett viktigt steg i många laboratorium protokoll. Här visar vi RNA-extraktion från hela zebrafisk embryon och cDNA syntes för senare tillämpning i olika experimentella procedurer inklusive genuttryck microarray analys.

Abstract

Många viktiga och komplexa laboratorie procedurer kräver en insats av hög kvalitet, intakt RNA. En försämrad prov eller förekomsten av föroreningar kan leda till katastrofala resultat i senare experimentella applikationer. Det är därför av yttersta vikt att använda fasta tekniker med många skyddsmekanismer och kvalitetskontroller kontroll för att garantera en överlägsen prov. Häri har vi detaljerat ett protokoll för att isolera totala RNA från hela zebrafisk embryon med ett kommersiellt tillgängligt kemiskt denatureringsmedel och efterföljande sanering för att avlägsna spår av DNA och föroreningar med ett kommersiellt RNA isolering kit. Eftersom RNA är relativt instabil och lätt utsatt för klyvning av RNaser, de flesta protokoll analys genuttryck med hjälp av ett cDNA produkt som är direkt syntetiseras från en RNA-mall. Vi detalj ett förfarande för att omvandla RNA till den mer stabila cDNA produkten med en kommersiellt tillgänglig kit. Under dessa förfaranden finns det många kvalitetskontroller för att säkerställa att provet inte är ned eller förorenats. Slutprodukten av dessa protokoll är cDNA som är lämplig för microarray analys, RT-PCR eller långvarig lagring.

Protocol

Del 1: Utvinning av Total RNA med hjälp TRIzol Reagent

När du arbetar med RNA är det mycket viktigt att arbeta i en miljö som är fri från RNaser. Enkla försiktighetsåtgärder som att ha reserverat pipetter endast för användning med RNA förfaranden och sprutning arbetsområdet med ett saneringsmedel reagens (t.ex. RNAse Borta) innan proceduren är mycket hjälpsam.

1. För att uppnå en tillräcklig mängd RNA pool 50 zebrafisk embryon i ett 1,5 ml mikrofugrör och ta bort så mycket vatten som möjligt med en pipett.
2. Tillsätt omedelbart 250 ìl TRIzol reagens ¹ till mikrofugrör innehåller embryon. TRIzol reagens innehåller fenol och ska endast användas under ett dragskåp.
3. Lyse och homogenisera de embryon med en pellets mortelstöt (ca 20 slag) tills vävnaden är tillräckligt störs.
4. När cellerna är tillräckligt homogeniserade, tillsätt 750 l TRIzol reagens till lika en total volym på 1 ml.
5. För att möjliggöra fullständig dissociation av nukleoprotein komplex, inkubera homogeniserad prov i 5 minuter i rumstemperatur. I detta skede kan provet flash frysas i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C eller protokollet kan fortsätta.
6. För att fortsätta lägga 0,2 ml kloroform och rock röret i 15 sekunder för att blanda.
7. Inkubera provet i 2 minuter i rumstemperatur och sedan centrifugera vid 12.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
8. Blandningen kommer att dela upp i en lägre röd fenol-kloroformfasens, en interfas, och en färglös övre vattenfasen. Den övre vattenfasen innehåller RNA. Det översta lagret ska bestå av ca 60% av den ursprungliga volymen av TRIzol (ca 0,6 ml). Överför den övre vattenskiktet i en ny mikrofugrör använda en 1 ml pipett försiktigt så att inte överlåta någon av de interfas lagret.
9. Att fälla ut RNA Tillsätt 0,5 ml isopropanol.
10. Låt provet sitta vid rumstemperatur i 10 minuter och centrifugera sedan provet vid 12.000 xgi 10 minuter vid 4 ° C. RNA bildar en gel-liknande pellet på botten av röret.
11. Utan att störa pelleten, avlägsna supernatanten med en pipett och tvätta pelleten i 1 ml 75% etanol. Blanda provet genom att vända försiktigt och centrifugera vid 7500 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
12. Efter centrifugering, avlägsna etanol med en pipett och låt provet torka medan omvänt i 10 minuter.
13. Suspendera pelleten genom att tillsätta 100 ìl RNAse-fritt vatten och inkubera provet vid 55 ° C i 10 minuter. Det rekommenderas att fingret virvel ofta under inkubation till stöd i RNA rehydrering. Alternativt kan du kontrollera prov kvalitet och kvantitet med hjälp av en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer eller direkt vidare till nästa steg.

Del 2: RNA Cleanup med Qiagen RNEasy Mini Kit

Den Qiagen RNEasy Mini Kit ² är användbar i avlägsna föroreningar och orenheter från en RNA-prov isolerade från andra metoder. För detta förfarande, är β-merkaptoetanol, etanol och nukleasfritt vatten som behövs utöver de komponenter som ingår i satsen. En valfri DNAse behandling rekommenderas under denna procedur.

1. Vid första användningen av kit, kommer Buffer RPE behöver förberedas genom att lägga till 4 volymer på 100% etanol till en volym Buffer RPE.
2. På dagen för förfarandet kommer Buffert RLT måste beredas på nytt. Beräkna den totala mängden buffert RLT som kommer att behövas. En volym på 350 l behövs per prov. För att förbereda Buffert RLT, tillsätt 10 ìl av β-merkaptoetanol för varje 1 ml buffert. Detta bör göras under dragskåp.
3. För varje prov lägga 350 ìl Buffer RLT och 250 l på 100% etanol. Blanda väl genom att pipettera upp och ned flera gånger.
4. Överför provet, som bör vara ca 700 l, till ett RNEasy kolumn som är placerad i en 2 ml provrör och centrifugera vid 8000 xg i 1 minut vid rumstemperatur.
5. Efter centrifugering, kasta flödet genom och tillsätt 700 ìl av Buffer RW1 till en RNEasy snurra kolumn.
6. Centrifugera provet vid 8000 xg i 1 minut vid rumstemperatur och sedan kasta flödet genom.
7. DNAse behandling med Qiagen RNAse-Free DNAse Kit: DNAse behandling är valfri men rekommenderas för högsta kvalitet prover.
   1. När du först får DNAse behandling kit, måste du förbereda DNAse jag stamlösning genom att tillsätta 550 l nukleasfritt vatten till DNAse. Blanda försiktigt genom att vända och inte skaka. Fördela i injektionsflaskor för engångsbruk innehåller 10 ìl av stamlösning. Du kan lagra stamlösning vid -20 ° C i upp till 9 månader. Den upptinade portioner kan lagras vid 4 ° C i 6 veckor om det behövs, men inte frysas på nytt de alikvoter efter upptining.
   2. För att förbereda DNAse jag inkubationen blanda lägga till 70 l buffert FUD till 10 l DNAse jag stock lösning per prov. Blanda genom att vända försiktigt och centrifugrör kort att samla in resterande flytande form sidorna av röret. Tillsätt 80 l DNAse jag inkubation blandar direkt till RNEasy snurra kolumnen. Inkubera DNAse behandling i 30 minuter vid rumstemperatur.
8. Efter DNAse behandling lägga 350 l Buffer RW1 att snurra kolonnen och centrifugera vid 8000 xg i 1 minut vid rumstemperatur.
9. Efter centrifugering kassera flödet genom och tillsätt 500 l Buffer RPE att snurra kolumnen. Inkubera prov i 5 minuter i rumstemperatur.
10. Centrifugera provet vid 8000 xg i 1 minut vid rumstemperatur och kasta passera.
11. Efter centrifugering lägga 500 l 75% etanol till de snurra kolumnen.
12. Upprepa centrifugering vid 8000 xg, men i 2 minuter i rumstemperatur.
13. Efter centrifugering kassera flödet genom och att kolonnen torka i 5 minuter.
14. Omedelbart Centrifugera vid 8000 xgi 5 minuter vid rumstemperatur för att ta bort några kvar spår av etanol.
15. Efter centrifugering är slutförd överföra spin kolumn till en ny 1,5 ml provrör och tillsätt 10 l nukleasfritt vatten. Inkubera i 1 minut och centrifugera vid 10000 xg i 1 minut vid rumstemperatur. RNA kommer att vara i flödet genom.
16. Lägg till ytterligare 10 ìl nukleasfritt vatten till spin kolumnen och inkubera vid rumstemperatur i 1 minut. Centrifugera provet vid 10.000 xg i 1 minut vid rumstemperatur.
17. Efter centrifugering Ta bort och kasta snurra kolumnen. RNA kommer att vara i flödet genom.
18. Kolla kvantitet och kvalitet av RNA med hjälp av en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer enligt tillverkarens anvisningar.
19. Dessutom kör en denaturering gel eller använda en Agilent 2100 bioanalyzer att kontrollera integriteten av RNA.
20. Proverna skall förvaras vid -80 ° C tills cDNA syntes kan utföras.

Del 3: cDNA syntes med Invitrogen Upphöjd Första Strand System

RNA är lätt benägen att klyvningen av RNaser som leder till nedbrytning. Som ett resultat av många genuttryck protokoll har utvecklats för att använda en mer stabil cDNA produkt som har direkt syntetiseras från RNA. Här har vi närmare syntes av första strängen cDNA med hjälp av Invitrogen Upphöjd Första Strand Synthesis System ^3. Varje cDNA syntes reaktion kan rymma upp till 5 mikrogram av RNA.

1. Innan du börjar proceduren mix och kort Centrifugera varje komponent.
2. Förbered RNA / primer blandningen i en steril 0,5 ml mikrofugrör som beskrivs i tabell 1.
3. Inkubera provet vid 65 ° C i 5 minuter.
4. Överför omedelbart provet till is slam i 10 minuter.
5. Medan provet kyls förbereda en Master Mix med de komponenter som beskrivs i tabell 2. Volymerna är listade per 1 reaktion. Justera volymerna därför för det totala antalet reaktioner.
6. Efter kylning, tillsätt 9 ìl av Master Mix upprättats i steg 5 till varje RNA / primer blandning. Blanda försiktigt och samla in med kort centrifugering. Den totala volymen av varje prov bör vara 19 l.
7. Inkubera provet vid 42 ° C i 2 minuter i en termocykler.
8. Tillsätt 1 l (50 enheter) av upphöjd II RT till varje rör, blanda och inkubera vid 42 ° C i 60 minuter i en termocykler.
9. Avsluta reaktionen vid 70 ° C i 15 minuter och sedan kyla prov till 4 ° C. En termocykler kan programmeras för steg 8 och 9.
10. Efter provet har nått 4 ° C, överföra reaktion på ett isbad.
11. På is tillsätt 1 ìl RNAse H till varje rör och inkubera i 20 minuter vid 37 ° C. Den totala volymen är nu 21 l. Tillägg av RNAse H ditt prov kommer att försämra RNA-mall och lämnar endast den sträng cDNA produkt.

Del 4: cDNA Isolering och nederbörd

1. En 1,5 ml låsenhet gel tuben kommer att användas i isoleringen av cDNA produkten. Förbered en 1,5 ml fas tub lås gel genom centrifugering vid 12.000 xgi 2 minuter. Gelen bör alla vara på botten av röret.
2. Lägg till 81,5 l fenol (Tris-mättad, buffrad till pH 8,0), 81,5 ìl 24:1 kloroform Isoamyl alkohol, och provet (21 l) i fas låset gelen rör. Blanda flera gånger genom att vända försiktigt.
3. Centrifugera provet vid 12.000 xgi 5 minuter vid rumstemperatur.
4. Den cDNA ska vara i den övre vattenfasen. Överför den övre fasen till ett rent 1,5 ml mikrofugrör. Den totala volymen bör vara cirka 20 l.
5. Lägg 1X volym 3 M NaOAc, pH 5,2 och blanda försiktigt. Till exempel, om volymen av den övre vattenfasen var lika med 20 l, måste du lägga till 2 l på 3 miljoner NaOAc, pH 5,2.
6. Tillsätt 7 l av 5 mg / ml glykogen och blanda försiktigt.
7. Lägg 1X volym av isopropanol och blanda försiktigt. Generellt så är cirka 30 l isopropanol.
8. Låt provet inkubera i rumstemperatur TemperaturE för 10 minuter och sedan centrifugera vid 12.000 xg under 20 minuter vid rumstemperatur.
9. En liten cDNA pellets bör ligga på botten av röret. Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett.
10. Tillsätt 500 ìl av 70% etanol och blanda genom inversion.
11. Centrifugera provet vid 12.000 xgi 5 minuter.
12. Efter centrifugering avlägsna supernatanten med en pipett och upprepa 70% etanol tvätt och centrifugering (steg 10 och 11).
13. Efter centrifugering avlägsna supernatanten med en pipett. Om det finns vätska kvar på sidorna av röret, kan det samlas in av en kort stund att snurra på röret. Ta bort överflödig vätska och låt pellets torka i rumstemperatur i 5 minuter.
14. Tillsätt 20 l nukleasfritt vatten att rehydrera pelleten. Placera provet vid 55 ° C i 5 minuter för rehydrering av pelleten.
15. Kvantitet och kvalitet av cDNA produkten kontrolleras sedan med hjälp av en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer enligt tillverkarens anvisningar. Den cDNA kan förvaras vid -20 ° C.

Representativa resultat

Efter RNA rengöring, kan cirka 15 mikrogram av hög RNA kvalitet totalt förväntas från 50 zebrafisk embryon. För att bedöma den totala RNA kvalitet, en spektrofotometer, gelelektrofores och en Agilent 2100 Bioanalyzer kan användas. En NanoDrop ND-1000 spektrometer kan användas för att bedöma absorbansen vid 260 nm i jämförelse med absorbansen vid 280 nm (Figur 1). _A-260 / A ₂₈₀ Förhållandet kan avslöja förekomsten av föroreningar och ge bevis på eventuella nedbrytning. En A ₂₆₀ / A ₂₈₀ Förhållandet mellan 1,9-2,0 anses godtagbart. Dessutom är det starkt rekommenderat att en RNA denaturering gel köras för att bedöma RNA integritet. RNA-strängen kommer att skilja på grund av sin storlek, med mindre delar flyttar längre ner gelen. En icke-nedbrutna prov kommer att visas som en smet med två starka band. Utstryket är ett resultat av en population av olika storlekar mRNA trådar och band motsvarar 28S och 18S rRNA. Den 28S Bandet bör vara ungefär dubbelt så intensiv som den 18S bandet (figur 2). Alternativt kan den totala RNA integriteten ska bedömas med hjälp av en Agilent 2100 bioanalyzer. Två distinkta toppar som representerar 28S och 18S rRNA förväntas (Figur 3). Den 28S toppen bör vara större än 18S toppen med en area under topparna ungefär 2:1, respektive. Två distinkta toppar kommer inte att observeras i försämrad prover. RNA-prover uppvisar degradering bör inte genomföras senare experimentella procedurer.

Spektrofotometrisk analys kan användas för att bedöma kvaliteten på det cDNA produkten (Figur 4). _A-260 / A ₂₈₀ bör ligga runt 1,8. cDNA reaktioner med en insats av 5 mikrogram av det totala RNA avkastningen rutinmässigt 1-2 mikrogram cDNA produkt i vårt laboratorium.

Figur 1. En NanoDrop spektrum av RNA-prov. Efter RNA rengöring, kan RNA kvantitet och kvalitet ska bedömas med hjälp av en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. Cirka 15 mikrogram av hög kvalitet totala RNA är rutinmässigt gav från 50 zebrafisk embryon med A ₂₆₀ / A ₂₈₀ ratio runt 1,9-2,0.

Figur 2. En RNA denaturering gel. För att bedöma integriteten av den totala RNA isolering, kan en RNA-denaturering gel sprang. En smeta med två ljusa band motsvarande 28S och 18S rRNA förväntas. Den 28S Bandet bör vara ungefär dubbelt så intensiv som den 18S bandet.

Figur 3. Ett spår av en RNA-prov från en bioanalyzer. För att bedöma integriteten av den totala RNA isolering, kan prover också analyseras på en Agilent 2100 bioanalyzer. Två vassa toppar, som motsvarar den 28S och 18S rRNA bör vara synliga. Den 28S toppen bör vara större än 18S toppen med en area under topparna ungefär 2:1, respektive.

Figur 4. En NanoDrop spektrum av ett cDNA prov. Spektrofotometrisk analys med en NanoDrop ND-1000 kan användas för att bedöma kvantitet och kvalitet cDNA produkten. _A-260 / A ₂₈₀ kvoten bör ligga runt 1,8. cDNA reaktioner med en insats av 5 ug av det totala RNA avkastningen rutinmässigt 1-2 ug av cDNA i vårt laboratorium.

Tabell 1. Komponenter att lägga för RNA / blandningar primer vid steg 2 av cDNA syntes.

Komponent	Volym
Total RNA (upp till 5 mikrogram)	10 l
10 mM dNTP mix	1 l
Oligo (dT) 12-18 (0,5 mikrogram / l)	1 l
DEPC-behandlat vatten	n l
Total volym	10 l

Tabell 2. Reaktionsblandning för steg 5 i cDNA syntes. Listade volymer per reaktion. Öka volymerna av varje komponent för det totala antalet reaktioner.

Komponent	Volym
10X RT Buffer	2 l
25 mM MgCl2	4 l
0,1 mM DTT	2 l
RNAseOUT	1 l

Discussion

Bräckligheten i RNA-molekylen är den mest kritiska ersättning som bör komma ihåg i hela detta protokoll. Steril utrustning som är RNAse utan ska alltid användas i en RNAse zon av laboratoriet. Det är bra att reservera en del av laboratoriet som ska användas för RNA rutiner bara. Detta område bör ofta besprutas med en RNAse ta bort produkten, såsom RNAse bort. RNA-prover bör alltid hanteras med handskar och förvaras på is för att förhindra nedbrytning.

Detta protokoll drog fördel av kommersiellt tillgängliga reagenser och kit. Alternativt finns det många fler reagenser och RNA-kit isolering som finns på marknaden för den totala RNA isolering. De reagenser och kit som ingår i detta protokoll har fungerat bra och rutinmässigt gav hög kvalitet RNA i vårt laboratorium.

Som ett alternativ kan dubbelsträngad cDNA syntes utföras, i stället för den första delen syntesen visats i detta protokoll. Dubbel strandsatta cDNA ibland önskat, eftersom det ger ökad stabilitet. Dessutom är vissa protokoll kräver dubbelsträngad cDNA produkter som ingång. Men om proverna kommer att hållas i huset för nedströms program är första delen syntes tillräckligt och är mycket mer ekonomiskt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycogen (5 mg/ml)	Ambion	9510
NanoDrop ND-100	Thermo Fisher Scientific, Inc.	ND-1000
Pellet Pestles with Microfuge Tube	VWR international	KT749520-0090
Phase Lock Gel Light, 1.5 ml	Eppendorf	2302800
Phenol, Tris-saturated	Roche Group	3117944001
RNAse Away	VWR international	17810-491
RNAse-Free DNase Set	Qiagen	79254
RNEasy Mini Kit	Qiagen	74104
SuperScript® First-Strand Synthesis System for RT-PCR	Invitrogen	11904-018
TRIzol	Invitrogen	15596-026