Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Summary

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Abstract

Vollen Einblick in die Mechanismen der lebenden Zellen kann nur durch die Untersuchung der wichtigsten Prozesse, und entlocken direkte Ereignisse auf zellulärer Ebene erreicht werden. Bis heute ist die Scher-Komplexität biologischer Systeme ist präzise Einzel-Molekül-Experimente verursacht weit zu anspruchsvoll sein, anstatt sich auf Studien einzelner Systeme mit relativ groben Schüttgut Ensemble-gemittelten Messungen. Allerdings treten viele wichtige Prozesse in der lebenden Zelle auf der Ebene von nur einem oder einigen wenigen Molekülen, Ensemble-Messungen in der Regel Maske der stochastischen und heterogene Natur dieser Ereignisse. Hier, mit Hilfe modernster optischer Mikroskopie und analytische Bild-Analyse-Tools zeigen wir, wie Proteine ​​innerhalb einer einzelnen lebenden Bakterienzelle mit einer Genauigkeit von einzelnen Molekülen und wie können wir die Dynamik innerhalb molekulare Komplexe in funktionierenden biologischen Maschinen beobachten zu überwachen. Die Techniken sind direkt relevant physiologisch. Sie sind minimal-perturbative und nicht-invasive, um die biologische untersuchten Probe an und sind für Untersuchungen in lebenden Material abgestimmt, verfügt nicht ohne weiteres verfügbar zu anderen Einzel-Molekül-Ansätze der Biophysik. Darüber hinaus untersuchten die biologischen Proben alle produzieren Fluoreszenz-markierten Protein in Konzentrationen, die fast identisch mit den unveränderten Zellen Stämme ("genomische encoding"), im Gegensatz zu den häufigeren, aber weniger idealen Ansatz für die Erzeugung deutlich mehr Protein als würde natürlich vorkommen entgegengesetzt sind ("Plasmid Ausdruck"). So sind die tatsächlichen biologischen Proben, die untersucht werden soll deutlich näher an den natürlichen Organismen und damit die Beobachtungen mehr relevant echten physiologischen Prozessen.

Protocol

1. Zu Beginn dieses Verfahrens wurden 50 ul eingefroren Bestände fluoreszierendes Protein exprimieren Escherichia coli Bakterienzellen werden zunächst aufgetaut und aerob unter Schütteln in 5 ml LB Nährmedien über Nacht bei 37 Grad C. Am Morgen gewachsen ist 50 ul dieser gesättigten Kultur extrahiert und Subkultur in minimal M63 Glukose Kulturmedien, Inkubation bei 30 ° C für 4 bis 6 Stunden. Hier zeigen wir mit zwei verschiedenen Zell-Stämme, von denen ein Elektron-Transport drückt Cytochrom fusioniert an GFP, die andere, die ein Protein in der bakteriellen Flagellen Motor fusioniert an GFP beteiligt ausdrückt.
2. Zellen können entweder direkt aus dem wachsenden Subkultur geerntet, wenn sie anzusehen als immobilisierte Proben, oder sie können geschert, um bakterielle Flagellen abschneiden, wenn Anzeige unter "angebunden" Bedingungen.
3. Shearing geht darum, in der Regel 1-5ml der Subkultur in ein Gerät, bestehend aus zwei sterile Spritzen mit sterilen Rohrleitungen verbunden. Die Scherung wird durch wechselseitiges Drücken in jedem Spritzenpumpe, die Kultur durch die engen Schlauch schieben getan. Dies ist 50-100 mal getan, je nach Ausmaß der Scherung erforderlich. Die Kultur wird dann zu Pellets der Zellen, die in Minimalmedium resuspendiert ist Geißeln Fragmente zu entfernen zentrifugiert.
4. Wir bereiten dann BK7 Deckgläser durch Eintauchen in eine gesättigte Lösung von KOH in Ethanol für 20 min gereinigt, gründliches Waschen in deionisiertem Wasser und Ethanol und verlassen an der Luft trocknen für mindestens 1 h
5. Wir bauen einen einfachen Flow-Zelle, die Zellen im Mikroskop Haus. Dazu gehört das Zeichnen von Linien von Paraffin Fett auf BK7 Glas-Objektträger und dann eine Tunnel-Sandwich, indem Sie eine der gereinigten coverlips oben und nach unten drücken vorsichtig mit einer Pinzette, mit einer Liefermenge Zellvolumen von 5-10 ul .
6. Zur Beobachtung immobilisierten Zellen füllen wir den Fluss-Zelle durch Injektion mit einer 0,1% w / v Lösung von Poly-L-Lysin, und lassen Sie es bei Raumtemperatur für mindestens 1 min inkubieren. Wir haben dann spülen mit 100 ul minimal Medien durch Einspritzen von den Medien von einem Ende des Flow-Zelle und Feuchtigkeitsregulierung mit Seidenpapier von den anderen.
7. Wir haben dann bis 20 ul einer 1:500 Verdünnung von 200 nm Durchmesser Latexmikrokügelchen (Polysciences) in Minimalmedium zu dem Deckglas Oberfläche markieren Docht. Die Flow-Zelle wird invertiert, so dass das Deckglas nach unten zeigt, auf einer Plattform deutlich von der Oberfläche in eine einfache feuchte Kammer gelegt, und über Nacht bei Raumtemperatur für 5 min. Unbound Kügelchen werden dann entfernt Feuchtigkeitstransport durch 100 ul Minimalmedium gewaschen.
8. Wenn wir angebunden Zellen zu beobachten, wollen wir auslassen des Poly-L-Lysin Schritt und stattdessen füllen Sie das Flow-Zelle mit 5 mg / ml anti-Flagellin-Antikörper. Die Flow-Zelle ist in der feuchten Kammer für 10 min und wird dann durch durch Feuchtigkeitsregulierung gespült.
9. 20 ul der Zellkultur wird dann durch das Flow-Zelle böse, entweder über die geschert Probe, wenn die Beobachtung angebunden Zellen oder die ungescherten Probe in Betrachtung immobilisierten Zellen.
10. Die Flow-Zelle wird umgedreht und in der feuchten Kammer für 20 min. Unbound Zellen werden dann durch Feuchtigkeitsregulierung durch 100 ul Minimalmedium gewaschen.
11. Ein Tropfen Immersionsöl ist in der Mitte der Oberseite des Deckglases gesetzt und die Flow-Zelle wird dann sanft auf den Probenhalter des custom built Fluoreszenzmikroskop platziert, wodurch optischen Kontakt mit der hohen numerischen Apertur Objektiv.
12. Das Mikroskop Elektron-Multiplikation Kamera eingeschaltet ist und die Kamera auf bis -70 Grad C gekühlt werden, ist die Software gesetzt, um Bilder in einem typischen Bildrate von 25 Hz in Frame-Transfer-Modus zu erwerben, zunächst disenabling den Gain-Regler auf der Kamera.
13. Die Hellfeldbeleuchtung wird eingeschaltet und das Bild wird in den Mittelpunkt gerückt, die Auswahl einer geeigneten Zelle oder Gruppe von Zellen auf der Grundlage ihres Seins mit ihrer Längsachse parallel zur Oberfläche Deckglas geklebt abgebildet werden. Der Schwerpunkt liegt dabei fein eingestellt, um sicherzustellen, dass die 200 nm Latexkügelchen hielt sich an die Oberfläche Deckglas gerade im Fokus sind.
14. Eine Bildsequenz in Hellfeld erworben, um den Umriss der Zellkörper aufnehmen. Das Hellfeld ist ausgeschaltet und die Kamera zu gewinnen ist auf maximal aktiviert.
15. Für einen Standard-Akquisition mit Total Internal Reflection Fluorescence (oder TIRF) mit einem Laserstrahl über entsprechende Wellenlänge (hier grün fluoreszierende Protein Anregung verwenden wir eine 473 nm-Laser) wird so in der hinteren Brennebene fokussiert werden voreingestellt das Objektiv, sondern seitlich von der optischen Achse verschoben, um eine evaneszente Feld für Fluoreszenzanregung in die Zelle Probe zu erzeugen.
16. Die Kamera Übernahme wird gestartet und der Laser Shutter geöffnet, um den fluoreszierenden Proteinen innerhalb der Bakterien erregen. Die Parameter für die Laser-Intensität und Geschwindigkeit des Erwerbs müssen für das jeweilige biologische System Gegenstand von Ermittlungen durch das Experimentieren mit verschiedenen Werten optimiert werden, aber eine typische Reichweite rELEVANT zu studieren mobilen Protein-Komplexe in der Zellmembran sind 1-10 mW Laserleistung über einen kreisförmigen Anregungsbereich mit einem Durchmesser von ~ 30 um, mit einer Belichtungszeit pro Einzelbild von 5-40 ms. Die Proben werden bis gebleicht, in der Regel für ~ 10 s. beleuchtet
17. Dieses Protokoll kann sowohl für die angebundenen Zellen, in denen die Körper der Zelle über einen Punkt der Befestigung zwischen dem Deckglas und Flagellen Stub dreht, und für immobilisierte Zellen, die fest mit dem Deckglas Oberfläche fixiert werden.
18. Einige Zellen Stämme, die eine hohe Kopienzahl von Komplexen aus einer anfänglichen beugungsbegrenzt fokussierten Laser Bleichmittel auf dem einen Pol der Zelle vor der TIRF Bildgebung profitieren. Das Bleichmittel ist gleichbedeutend mit, dass in Fluorescence Recovery After Photobleaching (oder FRAP) verwendet. Mit unseren Kunden Mikroskop einige der Anregung Laserlicht in ein zweites unabhängiges Pfad für FRAP-type Bleichen eingesetzt eingespeist werden. In der Regel 1-10mW Laserleistung verwendet wird, mit einem typischen Bleiche Zeit im Bereich 10-300 ms. Dies führt zu viel höheren Bildkontrast in der gebleichten Zone der Zelle ermöglicht einzelnen Komplexe, die anschließend in diesem Bereich diffuse leichter sichtbar gemacht werden.
19. Zur Visualisierung Komplexe im Zytoplasma der Zelle, die viel schneller als die in der Zellmembran eine andere Beleuchtung Modus namens "slimfield" beschäftigt ist diffus. Hier wird ein fokussierter Laserstrahl wird erweitert seitlich nur umfassen eine einzelne Zelle. Dadurch entsteht ein sehr intensives Feld ermöglicht viel schneller Aufnahmen von typisch einer Millisekunde zu ergreifen.
20. Nach der Datenerfassung werden die Bilder in eigens geschriebenen Software (codiert in LabVIEW 8.5) zugeführt. Dieser erkennt automatisch die Position der fluoreszierenden Flecken in den Zellen zu einer Genauigkeit von typischerweise wenigen Nanometern und Auszüge ihrer Größe und Helligkeit. Die brightnessof die photobleaching Trace mit Bezug auf die Zeit von ein Kettenfahrzeug molekularen Komplex dann verwendet wird, um die Stöchiometrie Schätzung, dh wie viele einzelne fluoreszierende Proteine ​​bilden eine einzelne molekularen Komplex.

Repräsentative Ergebnisse:

Wenn das Protokoll korrekt ausgeführt wird, die Bilder der Zellen im Hellfeld betrachtet wird sehr deutlich, mit dem Perimeter der Zellkörper dunkel gegen einen weiß / grau Zellkörper (Abb. 1a). In Fluoreszenz mit immobilisierten Zellen, können wir sehen deutliche Flecken Intensität, der typischerweise 250-300 nm in der Breite (Abb. 1b). Gesunde, gefesselte Zellen gesehen, um den Punkt der Leine Anlage im Hellfeld Bilder zu drehen. Unter Fluoreszenzanregung einige molekulare Komplexe in unserem Fall könnte auch an der Stelle der Befestigung zu sehen, was auf eine Lokalisierung des markierten Proteins mit der Flagellen-Motor. Diese Spots werden einzelne molekulare Komplexe und die Anzahl von ihnen gesehen wird auf die Beleuchtung Modus verwendet werden und wie viele der Komplexe sind tatsächlich in der Zelle anwesend zu einem beliebigen Zeitpunkt ab. Die Mobilität der Spots ist abhängig von der spezifischen biologischen untersuchte System. Wenn die Dichte der Flecken ist anfänglich sehr hoch, wie es der Fall mit den markierten Cytochrome hier verwendeten dann eine anfängliche FRAP Bleichmittel kann der Bildkontrast zu verbessern.

Abbildung 1. (A) Hellfeld-und (B) TIRF Bild (Fehlfarben) für eine immobilisierte Escherichia coli Zelle, die ein Protein fusioniert, um grün fluoreszierende Protein (GFP), die bekanntlich in der Flagellen-Motoren von Bakterien beteiligt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

Discussion

Es muss darauf geachtet nicht "über shear" Zelle für das Betrachten angebunden Bakterien, da dies die Funktionalität des Flagellen-Motoren beeinträchtigt werden. Es ist wichtig, um Zellen viel länger als eine Stunde einmal den Einsatz auf dem Objektträger, da sie sich möglicherweise Sauerstoff verbraucht. Erhebliche Optimierung erforderlich, um den besten Mikroskop Imaging Bedingungen gesorgt, spezifische biologische System untersucht werden. Es kann klug sein, um die Imaging unter Verwendung von gereinigten GFP allein auf die richtige Intensität Laseranregung für Ihre speziellen Mikroskop-System erforderlich zu ermitteln versucht.