Summary
نحن هنا لشرح البروتوكولات لأداء المفرد جزيء مضان المجهري على الخلايا البكتيرية الحية للتمكن من الكشف عن مجمعات الجزيئية وظيفية ، ومجنزرة كميا.
Abstract
ويمكن تحقيق الرؤية الكاملة في آليات الخلايا الحية فقط من خلال التحقيق في العمليات الرئيسية والمباشرة التي تثير الأحداث على المستوى الخلوي. إلى تاريخ القص تعقيد النظم البيولوجية تسبب دقيقة واحدة جزيء التجارب لتكون بعيدة جدا يطالبون ، والتركيز بدلا من ذلك على دراسة النظم واحد باستخدام معظم الخام نسبيا الفرقة المتوسط القياسات. ومع ذلك ، العديد من العمليات الهامة تحدث في الخلية الحية على مستوى واحد فقط أو جزيئات قليلة ؛ القياسات فرقة القناع عموما الطبيعة العشوائية وغير المتجانسة من هذه الأحداث. هنا ، وذلك باستخدام المجهر الضوئي المتطورة والأدوات التحليلية لتحليل الصور ونحن لشرح كيفية رصد البروتينات داخل الخلية الحية واحد البكتيرية إلى دقة واحدة من الجزيئات ، وكيف يمكننا مراقبة ديناميكية داخل مجمعات الجزيئية في أداء الأجهزة البيولوجية. التقنيات ذات الصلة مباشرة من الناحية الفسيولوجية. فهي طفيفة ، perturbative وغير الغازية لعينة بيولوجية هي قيد الدراسة ومتفهمين تماما عن التحقيقات في المادة الحية ، وميزات لا تتوافر لنهج واحد جزيء آخر من الفيزياء الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، درس جميع العينات البيولوجية إنتاج البروتين fluorescently الموسومة على المستويات التي تكاد تكون متطابقة مع سلالات خلايا معدلة ("ترميز الجينومية") ، على عكس النهج الأكثر شيوعا ولكن أقل مثالية لتوليد البروتين أكثر بكثير مما يمكن أن يحدث بشكل طبيعي ('التعبير البلازميد"). وبالتالي ، فإن العينات البيولوجية الفعلية التي سيتم التحقيق فيها هي أقرب إلى حد كبير في الكائنات الطبيعية ، وبالتالي المزيد من الملاحظات ذات الصلة على العمليات الفيزيولوجية الحقيقية.
Protocol
- لبدء هذا الإجراء ، يتم إذابة أول 50 ميكرولتر من الأسهم المجمدة للبروتين فلوري معربا عن كولاي ونمت الخلايا البكتيرية هوائيا مع اهتزاز وسائل الاعلام في 5 مل النمو LB بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في الصباح ، ويتم استخراج 50 ميكرولتر من هذه الثقافة المشبعة وشبه مثقف إلى الحد الأدنى من وسائل الاعلام M63 ثقافة الجلوكوز ، ويحتضنها في 30 درجة مئوية لمدة 4 الى 6 ساعات. هنا نظهر باستخدام اثنين من سلالات مختلفة من الخلايا ، واحدة منها يعبر عن نقل الإلكترون السيتوكروم تنصهر لGFP ، والآخر الذي يعبر عن بروتين يشارك في المحرك في سوطي البكتيرية لتنصهر GFP.
- قد تحصد الخلايا إما مباشرة من ثقافة فرعية المتنامية اذا يعتبرهم عينات ظائفها ، أو أنها قد تكون المنفصمة لاقتطاع سياط البكتيرية إذا عرض في ظل ظروف "المربوطة".
- القص ينطوي على وضع عادة 1 - 5ml ثقافة فرعية في جهاز يتكون من اثنين من المحاقن المعقمة انضم اليهم أنابيب معقمة. تتم عن طريق القص بالتناوب في كل مضخة دفع حقنة لدفع الثقافة من خلال الأنبوب الضيق. يتم ذلك 5-10 مرات ، اعتمادا على مدى القص المطلوبة. ثم يتم طرد ثقافة إلى الخلايا ، وبيليه الذي هو معلق في وسائل الإعلام الحد الأدنى لإزالة شظايا سياط.
- ثم علينا إعداد تنظيف الزجاج coverslips BK7 عن طريق غمر في محلول مشبع من كوه في الإيثانول لمدة 20 دقيقة ، ثم شطف جيدا في غير المتأينة المياه والايثانول ويترك ليجف في الهواء لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
- نبني بسيطة تدفق الخلية إلى الخلايا في منزل المجهر. وهذا ينطوي على رسم خطوط البارافين والشحوم على شريحة المجهر والزجاج BK7 ثم إنشاء نفق شطيرة من خلال وضع واحدة من coverlips تنظيف على أعلى ، والضغط برفق مع زوج من ملقط ، وإعطاء حجم الخلية تدفق ميكرولتر 50-10 .
- لمراقبة أداء وظائفها خلايا ملأنا تدفق الخلايا عن طريق الحقن بمحلول ث / ت 0.1 ٪ من بولي - L - يسين ، والسماح لها لاحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 دقيقة. ونحن بعد ذلك باستخدام تدفق وسائل الاعلام الحد الأدنى 100 ميكرولتر من خلال ضخ وسائل الإعلام من طرف واحد من الخلية التدفق وفتل مع المناديل الورقية من جهة أخرى.
- نحن الفتيل ثم من خلال 20 ميكرولتر من التخفيف من 1:500 قطرها 200 نانومتر المجهرية اللاتكس (Polysciences) في وسائل الإعلام الحد الأدنى للاحتفال سطح ساترة. هو مقلوب تدفق الخلايا بحيث ساترة إلى أسفل ، وضعت على منصة واضحة من سطح الرطوبة في غرفة بسيطة ، وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم تغسل حبات غير منضم بعيدا فتل من خلال وسائل الحد الأدنى من 100 ميكرولتر.
- إذا أردنا أن نلاحظ أننا الخلايا المربوطة بحذف خطوة بولي - L - يسين ، وبدلا من ملء التدفق الخلوي مع 5 الأضداد المضادة للفلاجيلين ملغ / مل. تدفق الخلايا هي المكان الرطوبة في الغرفة لمدة 10 دقيقة ومن ثم من خلال مسح بواسطة فتل.
- 20 ميكرولتر للثقافة الخلية ثم الشريرة من خلال الخلية التدفق ، وذلك باستخدام إما عينة المنفصمة إذا مراقبة الخلايا المربوطة أو في عرض عينة unsheared الخلايا وظائفها.
- هو مقلوب تدفق الخلايا ووضعها في غرفة لمدة 20 دقيقة الرطوبة. ثم يتم غسل الخلايا غير منضم بها فتل من خلال وسائل الحد الأدنى من 100 ميكرولتر.
- يتم وضع قطرة من زيت الغمر في وسط السطح العلوي للساترة ويوضع بعد ذلك على تدفق الخلايا برفق على لصاحب العينة من المجهر مضان مخصصة بناؤها ، مما يجعل الاتصال البصري مع فتحة عدسة رقمية عالية الهدف.
- تشغيل المجهر الإلكترون ضرب الكاميرا والكاميرا المقرر أن يتم تبريده إلى -70 درجة مئوية ، يتم تعيين البرنامج إلى الحصول على صور بمعدل إطار نموذجي من 25 هرتز في الإطار نقل واسطة ، disenabling مبدئيا على السيطرة على الكاميرا.
- يتم تبديل الإضاءة على brightfield ويتم إحضارها إلى التركيز على الصورة ، واختيار المناسب خلية أو مجموعة من الخلايا المراد تصويره على أساس تمسك يجري بالتوازي مع محورها الطويل إلى السطح ساترة. يتم ضبط دقة والتركيز على ضمان 200 نانومتر اللاتكس الخرز عالقا على السطح ساترة ليست سوى في التركيز.
- ويتم الحصول على تسلسل الصور في brightfield لتسجيل الخطوط العريضة للجسم الخلية. يتم تبديل الإضاءة brightfield قبالة وتمكين الحصول على الكاميرا إلى الحد الأقصى.
- لاقتناء باستخدام معيار إجمالي مضان التأمل الداخلي (أو TIRF) شعاع الليزر على الطول الموجي المناسب (هنا ، للأخضر الإثارة بروتين فلوري ، ونحن نستخدم الليزر نانومتر 473) غير محددة مسبقا بحيث تكون مركزة في مؤخرة الطائرة البؤرية عدسة موضوعية بل أفقيا النازحين من المحور البصري لتوليد حقل زائل عن الإثارة مضان في عينة الخلايا.
- بدء اقتناء كاميرا والليزر فتح مصراع لإثارة البروتينات الفلورية داخل البكتيريا. المعلمات ليزر كثافة وسرعة اكتساب حاجة إلى أن يكون الأمثل للنظام بيولوجية معينة قيد التحقيق من قبل تجريب قيم مختلفة ، ولكن مجموعة نموذجية صelevant لدراسة مجمعات البروتين المحمول في غشاء الخلية 10-10 ميغاواط طاقة الليزر على منطقة الإثارة دائرية قطرها 30 ميكرومتر ~ ، مع زمن التعرض لكل إطار من 5-40 مللي. هي مضيئة عينات حتى photobleached ، وعادة لS. 10 ~
- ويمكن استخدام هذا البروتوكول على حد سواء لخلايا المربوطة فيها الجسم للخلية يدور حول نقطة التعلق بين ساترة وكعب سوطي ، وثبتوا للخلايا التي يتم إصلاحها بشكل صارم إلى السطح ساترة.
- بعض سلالات الخلايا التي لديها عدد كبير من المجمعات نسخة تستفيد من وجود مواد التبييض الأولي حيود محدودة ليزر تركز على قطب واحد من الخلية قبل TIRF التصوير. هذا ما يعادل التبييض التي تستخدم في الانتعاش بعد مضان photobleaching (أو FRAP). ويمكن استخدام المجهر عادتنا أن يتغذى بعض الإثارة في ضوء الليزر قبالة مسار مستقل عن FRAP الثانية المستعملة من نوع التبييض. عادة ما يتم استخدام 1 - 10mW قوة الليزر ، مع وقت التبييض نموذجية في نطاق 10-300 مللي. هذه النتائج في المقابل التصوير أعلى بكثير في منطقة المبيضة للخلية السماح المجمعات الفردية التي نشرها لاحقا في هذا المجال إلى أن تكون أكثر سهولة تصور.
- لتصور المجمعات في السيتوبلازم الخلية التي منتشر بشكل أسرع بكثير من تلك الموجودة في غشاء الخلية يعمل وضع إضاءة مختلفة تسمى "slimfield". هنا يتم توسيع ليزر تركز أفقيا لتشمل مجرد خلية واحدة. هذا ينتج حقل مكثف جدا بحيث تجيز اتخاذ التعرض أسرع بكثير من ميلي ثانية واحدة a عادة.
- بعد الحصول على البيانات ، ويتم تغذية هذه الصور في برنامج مخصص مكتوبة (مشفرة في ابفيو (LabVIEW) 8.5). تلقائيا بالكشف عن هذه المواقف من البقع الفلورسنت في الخلايا إلى دقة عادة بضعة نانومتر ومقتطفات حجمها والسطوع. وbrightnessof ثم يتم استخدام التتبع photobleaching فيما يتعلق وقت مجمع الجزيئية مجنزرة لتقدير رياضيات الكيمياء ، أي كم من البروتينات الفلورية الفردية تشكل واحدة معقدة الجزيئية.
ممثل النتائج :
عندما يتم بشكل صحيح بروتوكول صورا لعرضها في الخلايا brightfield متميزة للغاية ، مع محيط من الهيئات زنزانة مظلمة ضد خلايا الجسم أبيض / رمادي (الشكل 1A). في الخلايا باستخدام مضان يجمد ، يمكننا أن نرى متميزة البقع كثافة من 250-300 نانومتر عادة في العرض (1B الشكل). سيتبين صحية ، والخلايا المربوطة لتدوير حول نقطة التعلق حبل brightfield في الصور. قد مضان تحت الإثارة أيضا بعض المجمعات الجزيئية في حالتنا أن ينظر في نقطة المرفق ، مما يدل على توطين البروتين المفتاحية مع المحرك سوطي. هذه البقع هي مجمعات الجزيئية الفردية ويرى عدد منهم سيتوقف على وضع الإضاءة المستخدمة وكيفية العديد من المجمعات موجودة فعلا في الخلية في أي وقت واحد. التنقل من البقع يعتمد على النظام البيولوجي محددة قيد الدراسة. إذا كانت كثافة البقع في البداية مرتفعة جدا ، كما هو الحال مع cytochromes المسمى المستخدمة هنا ، وبعد ذلك أداء التبييض FRAP الأولي يمكن تحسين التباين التصوير.
الشكل 1. (A) Brightfield و (ب) TIRF صورة (لون كاذبة) لخلية يجمد القولونية التعبير عن بروتين تنصهر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) الذي يعرف أن تشارك في المحركات سوطي من البكتيريا. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويجب الحرص على عدم "على القص" خلية للنظر في البكتيريا المربوطة ، لأن ذلك قد يضعف من وظيفة المحركات سوطي. من المهم أن استخدام الخلايا لفترة أطول من ساعة مرة واحدة على شريحة المجهر لأنها قد تصبح الأوكسجين المستنفد. قد تكون هناك حاجة كبيرة الأمثل للعثور على أفضل مجهر ظروف التصوير تهتم لنظامك البيولوجي محددة في إطار التحقيق. قد يكون من الحكمة لمحاولة تنقية التصوير باستخدام GFP وحده للتأكد من كثافة الليزر الصحيح الإثارة المطلوبة للنظام الخاص بك مجهر خاص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نعترف ان التبرعات العينية من سلالات بكتيرية من المجموعات البروفيسور جوديث ارميتاج (جامعة أكسفورد ، المملكة المتحدة) والبروفيسور كونراد Mullineaux (جامعة كوين ماري في لندن ، المملكة المتحدة). ويتم تمويل مشترك من جانب IMD قسم الكيمياء الحيوية (جامعة أكسفورد) وOCISB ؛ وتمول من قبل AR الهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EPSRC) DTC دراسية ل؛ يمول ND من التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC) ؛ هو MCL بتمويل من زمالة الجمعية الملكية للبحوث الجامعة.
References
- Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
- Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).
- Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay. Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).
- Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay. FEBS Lett. , 535-555 (2003).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane. Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane. Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli. Biophys. 93, 294-302 (2007).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells. Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).
