Summary
内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）は血管の恒常性と修復を研究するために有望なツールです。
Abstract
本論文では、ヘパリンから内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）のための新規な復旧戦略を導入し、それ以外は12日間の平均値内に成人ヒト末梢血をunmanipulated。大規模な展開の後に> 1 × 10 8 ECFCsは更なる試験のために取得することができます。有利にpHPLを使用してウシ血清抗原とヒト細胞の接触を排除することができます。フローサイトメトリーおよび免疫組織化学法により単離された細胞はECFCと構造がマトリゲルアッセイで試験することができるように血管を形成するためにin vitroでの機能として特徴づけることができる。さらにこれらの細胞は、皮下、in vivoで機能的、灌流血管を形成するために、マウスモデルに注入することができる。後の長期的な拡大と凍結保存、増殖、機能、ゲノムの安定性が保持されているように見える。3,4
この動物タンパク質フリーの分離と拡張メソッドはECFCsを大量に生成するために容易に適用可能です。
Protocol
A.）ECFC ISOLATON
1日目：
- あなたが実験を始める前に細胞培養培地内皮増殖培地-2（EGM - 2）を準備する。 、ヘパリン（1000 U / mlの1ミリリットル）、ペニシリン/ストレプトマイシン（すべてSigma社、セントルイス、MO 5mlの100倍液で500ミリリットル内皮基礎培地- 2を補足www.sigmaaldrich.com 、L -グルタミン（2mMの最終濃度） ）、および50mlプールされたヒト血小板溶解液（pHPL）。 、0.2 mlのヒドロコルチゾン、2ミリリットルhFGF - B、0.5ミリリットルVEGF、0.5ミリリットルEGF、0.5ミリリットルIGF - 1と0.5ミリリットルアスコルビン酸（SingleQuotsとして提供される、すべてのロンザ、ウォーカー、MDを追加します。 http://www.lonzabioscience。 COM / ）。無菌ろ過0.2メートル、細孔径500ミリリットルミリポア真空フィルタを通して培地。 pHPLは小さな血栓を形成するので、1つの媒体のための二つのフィルタが必要な場合があります。プリウォームフィルタリングEGM - 2〜37℃の水浴で
- 6ミリリットル防腐剤フリーナトリウムヘパリンの血液バキュテイナ管に肘静脈からのヒト成人末梢血5mlを描画することにより、血液サンプルを収集する。次の2つの時間の最大値内で血液サンプルを処理する必要があります。
- ベントキャップ、一つ25mlのピペットと層流のベンチで2つ5ミリリットルピペットとフラスコ、一つ75センチメートル2（コスターT75）を準備することから始めます。
- プレフィル15ミリリットルは、予め温めておいた25mlのピペットとフラスコにEGM - 2を補った。今血液バイアルおよびサンプルフラスコに5 mlのピペットを用いてすべての5 mlを開きます。目の5 mlのピペットを用いて追加のEGM - 2の5mlで空の血液バイアルを洗浄します。 T75内の総容積は25 mlです。 37℃インキュベーターにフラスコと場所の通気キャップを閉じ° C、5％CO 2および24時間で95％の湿度。
2日目：
- 約24時間（一晩）した後は、非接着細胞を取り除くために中期の血液の混合を削除する必要があります。層流でこの準備two 25ミリリットルピペット三5ミリリットルピペット用、プレ暖かい20ミリリットル° Cの水浴中で37にEGM - 2（前日に準備）、30 mlのPBSを補った。
- インキュベーターからサンプルでフラスコを取り外し、25 mlのピペットで上清を取り除く。潜在的なコロニーの損傷を防ぐために、フラスコの表面を傷付けないように注意してください。静かに予め温めておいたPBSと傾く一方から他方へのフラスコ10 mlを加えることによって内側のフラスコの細胞接着表面を3回洗浄する。 PBS直ちに毎回と廃棄を削除します。
- フラスコに新鮮予め温めておいたEGM - 2の20 mlを加え、インキュベーターに戻すに置きます。このプロセスはデタッチしないように接続されたセルに対して可能な限り迅速かつ穏やかとして実行する必要があります。彼らは長い間にPBSでまたは室温で保存されている場合ECFCsは容易に切り離す。
- ECFC伸長を探している光学顕微鏡の低倍率を使用して2日目から始まる全身フラスコ隔日を通じて画面。コロニーは、コロニーの位置を示すフラスコの外側に上にマークを発見された場合。 flaksが5分以上インキュベーターの外であってはならないことに注意してください。
5日目：
- 五日目に播種した後、非接着細胞を除去する完全培地の変更を行います。 EGM - 2に37℃の水浴中と2つの25 mlのピペットを準備のこの目的のため事前に暖かい20ミリリットル用。
- 25mlのピペットを使用して完全培地を取り出して、できるだけ早く、新鮮な、予め温めておいた補充EGM - 2を追加します。細胞が乾燥しないに1分以上のための媒体なしのままにしないでください。インキュベーターに戻して置いて、毎日のフラスコをスクリーニング繰り返す。
- 新鮮な補充EGM - 2で、週に2回培地の30％を置き換えることにより、細胞を養う。
DAY 14から28：
- 石畳の形態を持つ典型的なコロニーは、12日目の周りに表示されます。各コロニーの位置を示すために、フラスコの上部外側にマークを付けます。単一細胞がデタッチを開始しない限り、コロニーは、28日目までに成長することができます。一度、一次コロニーは、それらがその大きさに応じて、14日目と28の間に収穫することができる確認されている。
B.）ECFC HARVEST
- 事前に暖かい5ミリリットルトリプシン0.05％/ EDTA、20 mlのPBSと5ミリリットル新鮮な補充EGM - 2。
- 完全にファルコンチューブ（潜在的なコロニーの損傷を防ぐために、フラスコの表面に触れないように注意を取る）にフラスコから培地を除去し、PBS予熱した10mlで慎重に細胞を洗浄。
- インキュベーター内で5分間5ミリリットルトリプシン/ EDTAとインキュベートする。それは有毒になるので細胞が以上の7分間トリプシンにさらされるべきではない。徹底的にフラスコの側面をタップすると細胞がデタッチするのに役立ちます。保存され使用される培地の約10mlを加えることによってトリプシンのプロテアーゼ活性を消失。
- 50ミリリットルファルコに細胞懸濁液を取り除くn個のチューブ。その後収穫された細胞懸濁液に添加されている10 mlのPBSで一回フラスコを洗ってください。 4℃で7分間300gで細胞懸濁液を遠心° Cは、細胞を回収し、トリプシンを除去する。上清を捨て、1mlのPBSですぐに細胞ペレットを再懸濁します。氷上に置きます。
- R.リカルドとK. PhelaniでJoveのプロトコルで説明されているように細胞数を決定します。5
C.）ECFC EXPANSION
- 1.1で説明したように）500ミリリットルEGM - 2を補足するものです。 37〜プレ暖かい℃の水浴でC。
- Nunc社、シカゴ、イリノイ;約2500 cm 2と文化空間を11 T220（225 cm 2）のまたは15 T175（175cm 2の ）またはいずれか4層の細胞の工場を（CF - 4準備http://www.nuncbrand 。com ）。さらに、2つの新鮮なベントキャップと層流ベンチで特別な滅菌漏斗が必要になります。
- 100の開始細胞密度でシードECFCsに細胞数のC / cm 2と計算が必要です。一つはCF - 4 252800細胞を500 mlの新鮮なEGM - 2に再懸濁させ、滅菌漏斗を使用してCF - 4に注いだ。 Closeをベントキャップ付き通気口とすべての4小麦粉との間の媒質の平等な分配を可能にする、CF - 4対1の経度の側に傾けます。その後、バックチャンバーを傾けて、ベントキャップの蓋を開きます。インキュベーターでCF - 4を置きます。
- CF - 4はコンフルエントになるまで、少なくとも週1回の培地の20％を変更します。
- 収穫の細胞は、トリプシン/ EDTAを70mlと約200 mlのPBSを使用して）Bに説明。
駐在結果
この分離法を用いて、我々は、12日目で一次コロニー形成を観察した。以前の研究では4.0の平均値±末梢血中の各MLから派生した0,8 ECFC -コロニーを回復することができた4 ECFCsは、典型的な石畳の外観を示した。大規模な展開の後、100細胞/ cm 2の播種密度で、我々は3雄と雌1匹のボランティア（26と50歳の間の年齢）から約30日間の合計で> 1 × 10 8細胞を得た。
このような条件下で培養ECFCは、増殖、機能およびゲノム的に安定であることが示された4さらに細胞をさらに使用するために液体窒素で（10％DMSOで）保存することができます。3,4
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Discussion
この小説の分離と拡張メソッドは、任意のセルの分離を（不要密度勾配）回避することで、より効率的で時間がかかり、簡単で効率的なプロセスであり、従来の手法よりも安価。ウシ抗原と推定されるその後のxenoimmunizationにpHPL接触を使用することによって除外されます。培養期間中に小さな血栓がpHPLによって引き起こされる、形成することができる。我々の経験に基づいて、これらの血栓がコロニー形成し、細胞増殖や機能には影響しません。
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Acknowledgments
著者は優秀な技術支援のためにpHPLとマルガレッタFrühwirthとダニエラターラーを提供するための博士カタリーナSchallmoserに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| preservative-free Heparin | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 2mM per EGM-2 | |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma-Aldrich | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
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| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
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| PBS | |||
| Four-layered cell factory (CF-4) | Corning | ||
| Sterile Funnel | Corning | ||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) | BD Biosciences | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
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| 50ml Falcon tubes | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 pore size sterile filter | EMD Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
