Summary
Endotelial colônia formando células progenitoras (ECFCs) são uma ferramenta promissora para o estudo da homeostase vascular e reparação.
Abstract
Este trabalho apresenta uma estratégia de recuperação da novela para colônia de células progenitoras endoteliais formando (ECFCs) de heparinizado mas de outra maneira não-manipulado sangue periférico humano adulto dentro de uma média de 12 dias. Após a expansão em grande escala> 1x10 8 ECFCs pode ser obtido para mais testes. Vantajosamente usando pHPL o contato de células humanas com antígenos soro bovino pode ser excluída. Por citometria de fluxo e imunohistoquímica das células isoladas podem ser caracterizadas como ECFC e sua funcionalidade vitro para formar estruturas vasculares, como pode ser testado em um ensaio de Matrigel. Além disso essas células podem ser subcutânea em um modelo de mouse para forma funcional, vasos perfundidos in vivo. Após a expansão a longo prazo e proliferação de criopreservação, função e estabilidade genômica parecem ser preservada 3,4.
Este isolamento de proteína animal-livre e método de expansão é de fácil aplicação para gerar uma grande quantidade de ECFCs.
Protocol
A.) ECFC ISOLATON
DIA 1:
- Antes de começar a preparar com a experiência da célula endotelial Crescimento meio de cultura Médio-2 (EGM-2). Suplemento 500ml endotelial Basal Medium-2 com heparina (1ml de 1000 U / ml), solução de 100x 5ml de penicilina / estreptomicina (todos Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-glutamina (concentração final de 2 mM ), e 50 ml de lisado de plaquetas agrupadas humano (pHPL). Em seguida, adicionar 0,2 ml de hidrocortisona, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml VEGF, EGF 0,5 ml, 0,5 ml de IGF-1 e 0,5 ml de ácido ascórbico (fornecido como SingleQuots, todos Lonza, Walkersville, MD; http://www.lonzabioscience. com / ). Estéril filtrado o meio através de um m-pore size 0,2 500 ml de filtro a vácuo Millipore. Desde pHPL formas pequenos coágulos que podem precisar de dois filtros para um médio. Pré-aquecer filtrada EGM-2 para 37 ° C em banho-maria
- Coletar as amostras de sangue, chamando 5 ml de sangue periférico humano adulto a partir da veia cubital em um tubo de 6ml conservante livre vacutainer heparina sódica-sangue. Você deve processar as amostras de sangue dentro de um máximo de duas horas.
- Comece por preparar um centímetro 75 2 (T75; Costar) frasco com uma tampa de ventilação, uma pipeta 25 ml e dois de 5 pipetas ml em uma bancada de fluxo laminar.
- Pré-preencher 15 ml pré-aquecido complementada EGM-2 para o balão com a pipeta de 25 ml. Agora, abra o frasco da amostra de sangue e todos os 5 ml com a pipeta de 5 ml para o balão. Lavar o frasco vazio de sangue com 5 ml de adicionais EGM-2 com o segundo pipeta de 5 ml. O volume total dentro da T75 é de 25 ml. Feche a tampa de ventilação do frasco e coloque em uma incubadora a 37 ° C, 5% CO 2 e umidade de 95% para 24 horas.
2 º DIA:
- Após aproximadamente 24 horas (durante a noite), você deve remover a mistura meio-sangue para se livrar de células não aderentes. Para este preparar duas pipetas de 25 ml e três pipetas 5 ml no fluxo laminar, pré-aquecer 20 ml de suplementada EGM-2 (preparada no dia anterior) e 30 ml de PBS a 37 ° C em banho-maria.
- Retirar o balão com a amostra da incubadora e remover todos os sobrenadante com uma pipeta de 25 ml. Tome cuidado para não arranhar a superfície frasco para evitar danificar qualquer colônia potencial. Lavar o frasco de superfície interna adesão celular três vezes suavemente adicionando 10 ml de PBS pré-aquecido e inclinando o frasco de um lado para o outro. Remover o PBS imediatamente cada vez e descarte.
- Adicionar 20 ml de EGM-2 pré-aquecido fresco para o frasco e colocá-lo de volta para a incubadora. Este processo deve ser realizado o mais rápido e suave quanto possível para as células anexado não para separar. ECFCs desprendem facilmente, se forem mantidos em PBS ou à temperatura ambiente para a longa.
- Tela através do frasco sistemicamente dias a cada segundo a partir de dois dias usando uma baixa ampliação de um microscópio de luz procurando conseqüência ECFC. Quando uma colônia é encontrado marca no topo do lado externo do frasco, indicando a posição da colônia. Note que o flaks não deveria estar fora da incubadora por mais de 5 minutos.
DIA 5:
- No quinto dia após a semeadura realizar uma mudança meio completo para remover as células não aderentes. Para este efeito, pré-aquecer 20 ml da EGM-2 para 37 ° C em banho-maria e preparar duas pipetas de 25 ml.
- Remova o meio completo, utilizando uma pipeta de 25 ml e adicionar fresco, EGM-2 pré-aquecido complementado o mais rapidamente possível. Células não deve ser deixado sem meio de mais de um minuto para evitar a secagem. Coloque de volta para a incubadora e repita o frasco de triagem diária.
- Alimentar as células, substituindo 30% da média complementado com novas EGM-2 duas vezes por semana.
DIA 14-28:
- Colônias com morfologia típica de calçada deve aparecer por volta do dia 12. Marcar a parte superior externa do frasco para indicar a posição de cada colônia. Permitir que as colônias de crescer até o dia 28, a menos que uma única célula começa a destacar. Uma vez, colônias primário foram identificados, podem ser colhidas entre os dias 14 e 28, dependendo do seu tamanho.
B.) ECFC HARVEST
- Pré-aquecer 5 ml de tripsina 0,05% / EDTA, 20 ml e 5 ml PBS fresco suplementado EGM-2.
- Remover completamente o meio do balão para um tubo Falcon (tomar cuidado para não tocar na superfície do frasco para evitar danificar qualquer colônia potencial) e lavar cuidadosamente as células com 10 ml PBS pré-aquecido.
- Adicionar 5 ml de tripsina / EDTA e incubar por 5 minutos na incubadora. As células não devem ser expostas à tripsina por mais de 7 min, uma vez que se torna tóxica. Exaustivamente batendo nos lados do frasco ajuda as células a separar. Saciar a atividade de protease tripsina, adicionando cerca de 10 ml do meio de cultura preservada utilizada.
- Anular a suspensão de células em um 50 ml Falcotubo n. Lavar o frasco uma vez com 10 ml PBS que é então adicionado à suspensão de células colhidas. Centrifugar a suspensão celular a 300 g por 7 min a 4 ° C para coletar as células e remover a tripsina. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular imediatamente em 1 ml de PBS. Manter no gelo.
- Determine o número de células, como descrito em um protocolo JOVE por R. Ricardo e Phelani K. 5.
C.) ECFC EXPANSÃO
- Suplemento 500 ml EGM-2, conforme descrito em A 1.1). Pré-aquecer a 37 ° C em banho-maria.
- Para cerca de 2500 cm 2 de espaço de cultura, quer preparar uma 11 T220 (225 cm 2) ou 15 T175 (175 cm 2) ou uma fábrica de células de quatro camadas (CF-4; Nunc, Naperville, IL; http://www.nuncbrand . com ). Além disso, você vai precisar de dois frescos de ventilação-caps e um funil especial estéril na bancada de fluxo laminar.
- Para ECFCs semente em uma densidade celular inicial de 100 c / cm 2 cálculo do número de células é necessário. Para uma CF-4 252.800 células são ressuspendidas em 500 ml fresco EGM-2 e derramado no CF-4 usando o funil estéril. Fechar um painel com a abertura cap-and-tilt a CF-4 lado longitude para um, permitindo uma distribuição igual do meio entre todas as quatro farinhas. Em seguida, incline a câmara para trás e abrir a tampa do respiradouro-cap. Coloque CF-4, em incubadora.
- Mudança de 20% do meio de pelo menos uma vez por semana até CF-4 é confluente.
- Células colheita, conforme descrito no B.) usando 70 ml de tripsina / EDTA e cerca de 200 ml PBS.
RESULTADOS REPRESENTANTE
Usando este método de isolamento observou-se uma colônia de formação primária no dia 12. Em um estudo anterior foram capazes de recuperar uma média de 4,0 ± 0,8 ECFC-colônias derivadas de cada ml de sangue periférico. ECFCs 4 mostrou uma aparência de pedra de calçada típica. Após a expansão em grande escala, com uma densidade de semeadura de 100 células / cm 2, obtivemos> 1 x 10 8 células em um total de aproximadamente 30 dias a partir de três voluntários do sexo masculino e 1 feminino (idade entre 26 e 50 anos).
ECFC cultivadas sob estas condições se mostraram proliferativa, funcional e genomicamente estável. 4 Além disso as células podem ser armazenadas (em 10% DMSO) em nitrogênio líquido para posterior utilização 3,4.
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Discussion
Este isolamento romance e método de expansão é um processo simples e eficiente que é mais eficiente e menos morosa, evitando qualquer separação de células (sem gradiente de densidade necessário) e menos caro do que as técnicas convencionais. Por meio de contato pHPL aos antígenos bovina e xenoimmunization subseqüentes putativa é excluído. Durante o período de cultivo pequenos coágulos podem se formar, causada pela pHPL. Baseado em nossa experiência esses coágulos não afetam a formação de colônias e proliferação celular ou função.
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Acknowledgments
Os autores agradecem a Dra. Katharina Schallmoser para fornecer pHPL e Margaretha Frühwirth e Daniela Thaler para assistência técnica excelente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| preservative-free Heparin | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 2mM per EGM-2 | |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma-Aldrich | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
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| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
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| PBS | |||
| Four-layered cell factory (CF-4) | Corning | ||
| Sterile Funnel | Corning | ||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) | BD Biosciences | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
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| 50ml Falcon tubes | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 pore size sterile filter | EMD Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
