Summary
Endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) vasküler homeostazı ve onarım çalışması için bir gelecek vaat eden bir araçtır.
Abstract
Bu kağıt heparinize gelen endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) için yeni bir kurtarma stratejisi tanıttı ama aksi takdirde ortalama 12 gün içinde yetişkin insan periferik kan unmanipulated. > 1x10 8 ECFCs büyük ölçekli bir genişleme sonra, daha ileri testler için elde edilebilir. Avantajlı pHPL ile sığır serum antijenleri ile insan hücrelerinin kişi hariç tutulabilir. Akım sitometri ve immünohistokimyasal olarak izole hücreler ECFC ve in vitro işlevselliği gibi vasküler yapılar oluşturmak için bir matrigel tayininde test edilebilir olarak karakterize edilebilir . Ayrıca bu hücrelerin subkutan bir fare modelinde in vivo olarak fonksiyonel, perfüze damarları oluşturmak için enjekte edilebilir. Uzun vadeli büyüme ve kriyoprezervasyon çoğalması sonra, fonksiyon ve genomik istikrar korunmuş gibi görünüyor. 3,4
Bu hayvansal protein izolasyonu ve genişleme yöntemi ECFCs bir büyük miktarda üretmek için kolay uygulanabilir.
Protocol
A.) ECFC ISOLATON
1. GÜN:
- Deney başlamadan önce, hücre kültür ortamı Endotel Büyüme Orta-2 (EGM-2) hazırlar. (Sigma, St Louis, MO 500ml Endotel Bazal heparin (1000 U / ml 1 ml) ile Orta-2, 5ml 100x çözüm penisilin / streptomisin Ek www.sigmaaldrich.com ), L-glutamin (2 mM nihai konsantrasyonu ) ve 50 ml toplanmış insan trombosit lizatı (pHPL). Ardından 0.2 ml hidrokortizon, 2 ml hFGF-B, 0.5 ml VEGF, 0.5 ml EGF, 0.5 ml IGF-1 ve 0.5 ml askorbik asit (SingleQuots olarak verilmiştir, tüm Lonza, Walkersville, MD eklemek http://www.lonzabioscience. com / ). Steril süzüntü 0.2 m gözenek boyutu 500 ml Millipore vakum filtresi ile orta. PHPL küçük pıhtıları formları için bir orta ve iki filtreler gerekebilir. Pre-sıcak süzülmüş EGM-2 37 ° C su banyosunda
- Yetişkin insan periferik kan kübital venden 5 ml 6ml koruyucu sodyum heparin kan vacutainer tüp içine çekerek kan örnekleri toplayın. En fazla iki saat içinde kan örnekleri işlemek gerekir.
- Bacalı kap, bir adet 25 ml pipet ve bir laminer akış tezgahı iki adet 5 ml pipetler şişesi, bir adet 75 cm 2 (Costar T75) hazırlayarak başlayın.
- Ön dolgu 15 ml, 25 ml pipet ile önceden ısıtılmış EGM-2 balonun içine desteklenmiş. Şimdi kan flakon ve 5 ml ölçülü balona pipetle 5 ml örnek açın. Ikinci 5 ml pipetle 5 ml ilave EGM-2, boş bir kan şişe ile durulayın. T75 içinde toplam hacim 25 ml. 37 ° ° C,% 5 CO 2 ve% 95 nem, 24 saat için bir kuluçka şişesi ve yer Bacalı-kapağını kapatın .
2. GÜN:
- Yaklaşık 24 saat sonra (gece boyunca) yapışık olmayan hücrelerin kurtulmak için orta-kan karışımı kaldırmanız gerekir. Laminer akış hazırlamak bu iki 25 ml pipetler ve üç adet 5 ml pipetler için, ön-sıcak 20 ml, bir su banyosunda 37 ° C EGM-2 (önceki gün hazırlanmıştır) ve 30 ml PBS desteklenmiş.
- Inkübatör örnek şişesi çıkarın ve 25 ml pipet ile tüm süpernatant kaldırmak. Herhangi bir potansiyel kolonisi zarar görmesini önlemek için balon yüzeyinde çiziklerin oluşmasına özen gösterin. Diğer bir tarafı hafifçe önceden ısıtılmış PBS ve devirme şişesi 10 ml ekleyerek iç şişesi hücre temas yüzeyi üç kez yıkayın. PBS, hemen her zaman ve atın çıkarın.
- Balona 20 ml taze önceden ısıtılmış EGM-2 ve inkübatör içine yerleştirin. Bu süreç, ayırmak için değil, bağlı hücreler için mümkün olduğunca hızlı ve yumuşak olarak yapılmalıdır. PBS içinde ya da oda sıcaklığında uzun süre için tutulur ECFCs kolayca ayırmak.
- Ekran sistemik her ikinci gün balondaki yoluyla düşük bir büyütme ECFC akıbet için arayan bir ışık mikroskobu kullanılarak iki gün başlayan. Bir koloni koloni konumunu gösteren balonun dış tarafında üst üste işareti bulunduğunda. Flaks kuluçka dışında 5 dakikadan fazla olmaması gerektiğini unutmayın.
5. Gün:
- Beşinci gününde tohumlama sonra yapışmaz hücreleri çıkarmak için tam bir orta değişim gerçekleştirmek. Bu amaçla ön-sıcak 20 ml EGM-2 37 ° C su banyosu ve iki adet 25 ml pipetler hazırlamak.
- 25 ml pipet kullanarak tam orta çıkarın ve mümkün olan en kısa sürede taze, önceden ısıtılmış takviye EGM-2 ekleyin. Hücreler kurutma önlemek için bir dakika daha fazla orta olmadan bırakılmamalıdır. Inkübatör içine yerleştirin ve şişeyi günlük tarama tekrarlayın.
- Taze takviye EGM-2 haftada iki kez,% 30 orta yerine hücreleri tarafından besleyin.
GÜN 14-28:
- Arnavut kaldırımı taş morfolojisi ile tipik kolonilerin etrafında 12 günde görünmelidir. Her koloninin konumunu belirtmek için balonun üst dış tarafında işaretleyin. Tek hücreleri ayırmak için sürece koloniler 28 gün kadar büyümeye izin verin. Sonra, birincil koloniler, büyüklüğüne göre 14 ile 28 gün arasında hasat edilebilir tespit edilmiştir.
B.) ECFC HASAT
- Pre-sıcak 5 ml tripsin 0.05% / EDTA, 20 ml PBS ve 5ml taze takviye EGM-2.
- Tamamen (herhangi bir potansiyel kolonisi zarar görmesini önlemek için balonun yüzeyine dokunmamaya özen) bir Falcon tüp içine şişeden orta kaldırmak ve 10 ml önceden ısıtılmış PBS ile hücreleri dikkatli bir şekilde yıkayın.
- Inkübatör 5 dakika için 5 ml tripsin / EDTA ve inkübe ekleyin. Toksik hale yana hücreleri fazla 7 dakika tripsin maruz olmamalıdır. Balonun tarafı iyice dokunarak hücreleri ayırmak için yardımcı olur. Korunmuş kullanılan kültür ortamı yaklaşık 10 ml ekleyerek tripsin proteaz aktivitesi Quench.
- 50 ml Falco içine hücre süspansiyonu çıkarınn tüp. Hasat edilen hücre süspansiyonu daha sonra eklenir şişeyi kez 10 ml PBS ile yıkayın. 4 7 dakika için 300 g hücre süspansiyonu Santrifüj ° C hücreleri toplamak ve tripsin kaldırmak için. Süpernatantı atın ve hemen 1 mL PBS içinde hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Buz üzerinde tutun.
- Vallahi bir protokolde R. Ricardo ve K. Phelani tarafından açıklandığı gibi hücre sayısını belirler. 5
C.) ECFC GENLEŞME
- Ek 500 ml EGM-2) A 1.1 'de tanımlanmıştır. Ön-sıcak - 37 ° C su banyosu.
- Nunc, Naperville, IL; yaklaşık 2500 cm 2 kültür alanı için 11 T220 (225 cm 2) veya 15 T175 (175 cm 2) ya da birinin dört katmanlı hücre fabrikası (CF-4 hazırlamak http://www.nuncbrand com ). Ayrıca iki tatlı havalandırma kapakları ve laminer akış tezgah özel steril huni gerekecektir.
- 100 bir başlangıç hücre yoğunluğu tohum ECFCs için hücre sayısı c / cm 2 hesaplanması gerekmektedir. Biri için CF-4 500 ml taze EGM-2 252.800 hücrelerinin yeniden süspanse ve steril huni kullanarak CF-4 dökülür. Bir havalandırma havalandırma kapağı ile kapatın ve 4 unları arasında orta eşit dağılımını sağlayan, CF-4 bir boylam yan yatırmak. Sonra odasına geri eğme ve havalandırma kapağının kapağı açın. CF-4 inkübatöre yerleştirin.
- CF-4 kadar en az haftada bir kez orta% 20 değiştirin konfluent.
- Hasat hücreler tripsin / EDTA 70 ml ve yaklaşık 200 ml PBS kullanarak) B. açıklanan.
TEMSİLCİSİ SONUÇLAR
Bu izolasyon yöntemi kullanarak 12 gün az ilkokul koloni oluşumu gözlemledi. Önceki bir çalışmada, ortalama 4.0 ± periferik kan her ml edilen 0,8 ECFC-sömürgelerde kurtarmak için başardık 4 ECFCs tipik bir Arnavut kaldırımı taş görünümü gösterdi . Büyük ölçekli genişleme sonra, ekim yoğunluğu 100 hücre / cm 2, 3 erkek ve 1 kadın gönüllüler (26 ve 50 yılları arasında yaş) yaklaşık 30 gün olmak üzere toplam> 1 x 10 8 hücre elde.
Kültür ECFC bu koşullar altında, proliferatif, fonksiyonel ve genomik istikrarlı olması gösterildi 4 Ayrıca hücrelerin daha sonra kullanmak üzere sıvı azot (% 10 DMSO) saklanabilir. 3,4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu roman izolasyon ve genişleme yöntemi, daha verimli ve daha az zaman alıcı ve herhangi bir hücre ayırma herhangi bir yoğunluk gradiyenti (gerekli) kaçınarak, geleneksel yöntemlere göre daha daha az pahalı bir basit ve verimli bir süreç. Büyükbaş antijen ve varsayılan sonraki xenoimmunization pHPL temas kullanarak dışındadır. Kültür dönemde küçük pıhtıları pHPL neden oluşturabilir. Tecrübelerimize dayanarak bu pıhtıları koloni oluşumu ve hücre çoğalması veya fonksiyon etkisi yoktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, mükemmel teknik destek için pHPL ve Margaretha Frühwirth ve Daniela Thaler sağlamak için Dr. Katharina Schallmoser teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial basal Medium-2 | Lonza Inc. | 500ml | |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza Inc. | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | |
| preservative-free Heparin | Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 2mM per EGM-2 | |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma-Aldrich | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
|
| Trypsin/1mM EDTA | Invitrogen | 7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
|
| PBS | |||
| Four-layered cell factory (CF-4) | Corning | ||
| Sterile Funnel | Corning | ||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | ||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) | BD Biosciences | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
|
| 50ml Falcon tubes | Falcon BD | ||
| 5ml Stripetts | Costar | ||
| 25ml Stripetts | Costar | ||
| Squeezer | Costar | ||
| 0,2 pore size sterile filter | EMD Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
References
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
