Summary
Ein Dissektionstechnik zur Entfernung des Gyrus dentatus aus adulten Maus unter einem Stereomikroskop wurde in diesem Video aufgezeichnet Protokoll demonstriert.
Abstract
Der Hippocampus ist eine der am häufigsten untersuchten Areale im Gehirn wegen der wichtige funktionelle Rolle in Memory-Processing und Lernen, seine bemerkenswerte Nervenzellen Plastizität und ihr Engagement in der Epilepsie, neurodegenerative Erkrankungen und psychische Störungen. Der Hippocampus ist der unterschiedliche Regionen zusammen, Gyrus dentatus, der hauptsächlich aus Nervenzellen Granulat und Ammonshorn, die vor allem Pyramidenneuronen umfasst, und den beiden Regionen werden sowohl anatomische und funktionelle Schaltungen verbunden. Viele verschiedene mRNAs und Proteine werden selektiv im Gyrus dentatus exprimiert, und Gyrus dentatus ist eine Seite der adulten Neurogenese, das heißt, neue Neuronen sind ständig im erwachsenen Gyrus dentatus generiert. Um zu untersuchen, mRNA und Protein-Expression spezifisch für den Gyrus dentatus, ist die Laser-Mikrodissektion häufig verwendet. Diese Methode hat jedoch einige Einschränkungen, wie zum Beispiel die Notwendigkeit für spezielle Apparate und komplizierte Handhabung. In diesem Video aufgezeichnet Protokoll, zeigen wir eine Dissektionstechnik zum Entfernen des Gyrus dentatus aus adulten Maus unter einem Stereomikroskop. Gyrus dentatus Proben unter Verwendung dieser Technik eignen sich für jede Assay, einschließlich Transkriptom-, Proteom-und Zellbiologie Analysen. Wir haben bestätigt, dass die präparierten Gewebe Gyrus dentatus ist durch die Durchführung real-time PCR des Gyrus dentatus-spezifische Gene, Tryptophan 2,3-Dioxygenase (TDO2) und Desmoplakin (DSP) und Ammonshorn bereichert Gene, Meis-related gene 1b (Mrg1b ) und TYRO3 Protein-Tyrosin-Kinase-3 (Tyro3). Die mRNA Expression von TDO2 und DSP im Gyrus dentatus Proben wurden bei offensichtlich höhere erkannt, während Mrg1b und Tyro3 wurden niedrigere, als die im Ammonshorn Proben. Zur Demonstration der Vorteil dieser Methode führten wir DNA-Mikroarray-Analyse unter Verwendung von Proben der gesamten Hippocampus und Gyrus dentatus. Die mRNA-Expression von TDO2 und DSP, die selektiv im Gyrus dentatus exprimiert, in der gesamten Hippocampus von alpha-CaMKII + / - Mäusen zeigte 0,037 und 0,10-fache Veränderungen im Vergleich zu der Wildtyp-Mäusen, bzw.. In der isolierten Gyrus dentatus, jedoch zeigten diese Ausdrücke 0,011 und 0,021-fache Veränderungen im Vergleich zu der Wildtyp-Mäusen, die zeigen, dass Veränderungen der Genexpression im Gyrus dentatus mit größerer Empfindlichkeit nachgewiesen werden. Zusammengenommen können diese bequeme und genaue Dissektionstechnik zuverlässig für Studien über den Gyrus dentatus konzentriert eingesetzt werden.
Protocol
Dissection der hippocampalen
- In einer tief narkotisierten Maus, sorgfältig sezieren das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie sie in eiskaltes Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
- In eine Petrischale mit eiskaltem PBS, schneiden das Gehirn entlang der Längsfissur des Großhirns mit einem chirurgischen Messer und schnitt den Regionen hinter Lambda (Mittelhirn, Hinterhirn und Kleinhirn).
- Legen Sie die Gehirnhälfte medialen Seite und, mit einer Pinzette vorsichtig entfernen das Zwischenhirn (Thalamus und Hypothalamus) im Rahmen einer Dissektionsmikroskop. Dies legt die mediale Seite des Hippocampus, so dass für die Visualisierung des Gyrus dentatus. Der Gyrus dentatus ist zu unterscheiden von Ammonshorn durch die Lücken zwischen ihnen. Eine Verletzung des Hippocampus oder Umgebung wird es immer schwieriger, die Gyrus dentatus zu isolieren.
- Legen Sie eine scharfe Nadelspitze (zB 27-Gauge-Nadel) in jeder Seite des Gyrus dentatus (Grenzen des Gyrus dentatus und Ammonshorn; Abbildung 1), und schieben Sie die Nadeln nur oberflächlich entlang der Septo-zeitliche Achse des Hippocampus zu isolieren Gyrus dentatus.
- Nehmen Sie den isolierten Gyrus dentatus mit einer Nadel oder einer Pinzette und legen Sie sie in ein Probenröhrchen. Die so erhaltenen Gyrus dentatus Gewebeprobe kann ab sofort für jeden Assay verwendet werden oder in eine Tiefkühltruhe für den späteren Gebrauch.
- Isolieren Sie die Gyrus dentatus von der anderen Gehirnhälfte mit der gleichen Methode.
Quantitative real-time PCR
Der Gyrus dentatus wurde unter Verwendung der oben genannten Methode und die übrigen Hippocampus wurde als Ammonshorn Probe von Wildtyp-Mäusen seziert. Real-time PCR von beta-Aktin, TDO2, DSP, Mrg1b und Tyro3 wurden mit dem Gyrus dentatus und der Ammonshorn Proben wie zuvor beschrieben 1 durchgeführt. Primer 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG und 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC wurden Mrg1b und GCCTCCAAATTGCCCGTCA und 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA für Tyro3 verwendet.
Microarray-Analyse
(- Mäuse alpha-CaMKII + /), wie beschrieben bisher 1 Microarray-Experimente wurden mit männlichen Wildtyp-Mäusen und Mäusen, die heterozygot für die alpha-Isoform der Calcium / Calmodulin-abhängige Proteinkinase II durchgeführt. Kurz gesagt, wurde RNA aus dem gesamten Hippocampus oder Gyrus dentatus von Wildtyp-und mutierten Mäusen isoliert mit einem Mouse Genome 430 2,0 Array (Affymetrix, Santa Clara, CA) hybridisiert, und jeder GeneChip wurde durch eine Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (GCS3000) gescannt . GeneChip Analyse wurde mit Microarray Analysis Suite Version 5.0 durchgeführt.
Discussion
Der Gyrus dentatus belegt ca. 25% bis 30% des Volumens des Hippokampus 2,3. Es hat eine einzigartige Zellzusammensetzung und spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen Funktionen des Gehirns. Daher sind Techniken, um die Gyrus dentatus zu isolieren für die Analyse der Ereignisse, die speziell treten in dieser Region.
Hier haben wir gezeigt, ein Verfahren zur effizienten sezieren Gyrus dentatus aus adulten Maus Hippocampus und bestätigt die Genauigkeit der Technik. Zunächst zeigte histologische Untersuchung, dass der Gyrus dentatus ohne Verunreinigung durch andere Regionen (Abbildung 1) wurde abgetrennt, was darauf hinweist, dass eine reine Gyrus dentatus Probe vorbereitet werden können.
Zweitens bestätigten wir, dass die präparierten Gewebe Gyrus dentatus ist durch die Durchführung real-time PCR des Gyrus dentatus-spezifische Gene, TDO2 und DSP-und Ammonshorn bereichert Gene, Mrg1b und Tyro3 4 (Abbildung 2). Die mRNA Expression von TDO2 (p = 0,000023; n ist = 4 bzw. 4) und DSP (p = 0,0000030; n ist = 4 bzw. 4) im Gyrus dentatus Proben wurden bei offensichtlich höhere erkannt, während Mrg1b (p = 0.000080; n ist = 4 bzw. 4) und Tyro3 (p = 0,00017; n ist = 4 bzw. 4) wurden niedrigere, als die im Ammonshorn Proben. Beta-Aktin-Expression nicht in diesen Proben unterscheiden (p = 0,11; n ist = 4 und 4, jeweils). So können wir überprüfen, ob der Gyrus dentatus genau wurde von der Durchführung solcher einfachen Echtzeit-PCR-Experimente seziert.
Drittens, um den Nutzen dieser Methode Dissektion beurteilen, haben wir die mRNA Expression von ganzen Hippocampus mit dem Gyrus dentatus. Whole Hippocampus und Gyrus dentatus von Wildtyp-(n ist = 9 bzw. 4) und alpha-CaMKII + / erhalten - Mäuse (n ist = 18 bzw. 4) wurden für die Microarray-Analyse aufbereitet und für alle Gene hat, die fach- Veränderung wurde durch Division der Mutante Wert durch die wild-type-Wert berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Veränderungen in mRNA-Expression, insbesondere des Gyrus dentatus-spezifische Moleküle wie DSP und TDO2, mit wurden bis zu einem 5-fache Steigerung der Empfindlichkeit in Gyrus dentatus Proben im Vergleich zum gesamten Hippocampus-Proben (Tabelle 1) festgestellt. Wir haben bereits gezeigt, dass alpha-CaMKII + / - Mäuse zeigen Verhaltensweisen der menschlichen psychiatrischen Störungen wie Arbeitsspeicher Defizite und eine übertriebene infradian Rhythmus 1,5 verwandt. Darüber hinaus sind morphologische und elektrophysiologische Eigenschaften des Gyrus dentatus Neuronen in mutierten Mäusen ähneln denen von unreifen Gyrus dentatus Nervenzellen im normalen Nagern, was darauf hinweist, dass die Neuronen in diesen mutierten Mäusen bis zur Endfälligkeit zu 1 zu entwickeln scheitern. Die unreifen Gyrus dentatus und down-regulierten Expression von DSP und TDO2 mRNA in alpha-CaMKII + / - Mäuse sind im Einklang mit dem Befund, dass DSP und TDO2 als Marker für reife Körnerzellen kann im Gyrus dentatus (Ohira et al verwendet werden, nicht veröffentlicht. Daten).
Zusammengenommen können diese bequeme und genaue Dissektionstechnik zuverlässig für Studien über den Gyrus dentatus konzentriert eingesetzt werden. Gyrus dentatus Gewebe unter Verwendung dieser Methode ist anwendbar auf andere Arten von Analysen sowie, einschließlich Proteomics und Zellbiologie Analysen.
Abbildung 1. Verification der isolierten Gyrus dentatus durch die histologische Untersuchung. A Frontalschnitt des Gehirns nach Trennung Gyrus dentatus wurde für Nissl-Färbung (links) verarbeitet, und eine schematische Darstellung von Gehirn der Maus atlas6 angepasst repräsentiert die etwa auf dem Niveau des Abschnitts in der linken Seite (rechts) gezeigt. Die Pfeile zeigen die Richtung der Nadelspitze Insertion. Scale-bar, 1 mm.
Abbildung 2. Nachweis der isolierten Gyrus dentatus durch real-time PCR. Der Gyrus dentatus und der Ammon s Horn von vier Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden real-time PCR von beta-Aktin, TDO2, DSP, Mrg1b und Tyro3 verarbeitet. Die Ergebnisse werden präsentiert als Mittelwert ± SEM. Für die statistische Analyse wurde Student s t-Test eingesetzt, und p-Werte eingehalten werden: beta-Aktin, p = 0,11; TDO2, p = 0,000023 (** 1); Dsp, p = 0,0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3); und Tyro3, p = 0,00017 (** 4).
Tabelle 1. . Microarray-Analyse der gesamten Hippocampus und Gyrus dentatus Gene differentiell in Gyrus dentatus und ganze Hippocampus von alpha-CaMKII ausgedrückt + / - Mäuse wurden durch die Berechnung der fold-change aus, dass in Wildtyp-Mäusen nachgewiesen bestimmt. Mäuse - Die Daten wurden auf statistische Signifikanz mit dem Student s t-Test zwischen Wildtyp-und alpha-CaMKII + / analysiert. Unter den Genen, deren Expression zeigte p <0,05 inGyrus dentatus von alpha-CaMKII + / - Mäusen im Vergleich zu der Wildtyp-Mäusen sind die Top-50 Gene aufgelistet. Beachten Sie, dass die Zahl von Proben für Gyrus dentatus viel weniger als jene für die ganze Hippocampus sind. AffyID, Affymetrix-Sonde Kennung; CKII, alpha-CaMKII + / - Mäuse, WT, Wildtyp-Mäusen.
| Gyrus dentatus (p <0,05) WT: n = 4, CKII + / -: n = 4 | Whole Hippocampus WT: n = 9, CKII + / -: n = 18 | |||||||
| Gene Titel | Genbank | AffyID | Falten Sie ändern | p-Wert | Falten Sie ändern | p-Wert | ||
| Desmoplakin | AV297961 | 1435494_s_at | 0,011018913 | 7.02694E-06 | 0,037021003 | 1.86126E-13 | ||
| Desmoplakin | AV297961 | 1435493_at | 0,014369734 | 7.86747E-06 | 0.04232106 | 1.00579E-12 | ||
| Tryptophan 2,3-Dioxygenase | AI098840 | 1419093_at | 0,020986484 | 5.23546E-09 | 0,101037776 | 4.14823E-13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0,075479901 | 1.05191E-08 | 0,234001154 | 1.66301E-15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0,079457767 | 1.40433E-07 | 0,177974715 | 3.9758E-12 | ||
| Thyreotropin-Releasing-Hormon-Rezeptor- | M59811 | 1449571_at | 0,103105815 | 0,003093796 | 0,801412732 | 0,283994361 | ||
| Ryanodinrezeptor 1, Skelettmuskel | X83932 | 1427306_at | 0,104825517 | 3.38513E-07 | 0,650685017 | 0,000308462 | ||
| nescient Helix Loop Helix 1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E-06 | 4,078815314 | 5.27E-11 | ||
| copine Familienmitglied IX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E-06 | 1,797304153 | 0,000296375 | ||
| Doublecortin-like Kinase-3 | BB326709 | 1436532_at | 0,109336662 | 1.95278E-07 | 0.56697229 | 2.62633E-08 | ||
| Calpain 3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0,111269769 | 8.07053E-06 | 0,370956608 | 2.04421E-14 | ||
| Erwachsene männliche corpus striatum cDNA, RIKEN in voller Länge angereichert Bibliothek, Klon: C030023B07 Produkt: unklassifizierbare, voll Insertsequenz | BB357628 | 1460043_at | 0,118712341 | 6.16926E-07 | 0,682339204 | 2.33001E-06 | ||
| Kollagen und Calciumbindevermögen EGF Domänen 1 | AV264768 | 1437385_at | 0,124043978 | 3.65669E-05 | 0,488394112 | 4.05538E-06 | ||
| Amyloid-beta (A4)-Precursor-Protein-Bindung, Familie A, Mitglied 2-Bindungsprotein | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E-06 | 2,099164713 | 1.67047E-06 | ||
| Calbindin-28K | BB177770 | 1456934_at | 0,130255444 | 3.32186E-06 | 0,572605751 | 1.99157E-10 | ||
| Transkribiert locus | AV328597 | 1443322_at | 0,133290835 | 5.43583E-06 | 0,562767164 | 7.56544E-06 | ||
| Neuropeptid Y-Rezeptor Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0,135319609 | 0,000113407 | 0,781498474 | 0.00394504 | ||
| ras responsive element binding protein 1 | BE197381 | 1428657_at | 0,138235114 | 7.93691E-07 | 0,651220705 | 2.94209E-05 | ||
| Glia-Zelllinie neurotrophen Faktor Familie Rezeptor alpha 2 | BB284482 | 1433716_x_at | 0,139062563 | 2.35371E-06 | 0,669544709 | 0,000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E-08 | 1,766018828 | 0,000250501 | ||
| RIKEN cDNA 1810010H24 Gen | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E-05 | 2.77573142 | 6.81865E-09 | ||
| Ryanodinrezeptor 1, Skelettmuskel | BG793713 | 1457347_at | 0,151364292 | 3.35612E-05 | 0,503144617 | 4.32907E-05 | ||
| Protocadherin 21 | NM_130878 | 1418304_at | 0,152671849 | 8.57783E-06 | 0,670714726 | 1.56309E-05 | ||
| cornichon homolog 3 (Drosophila) | NM_028408 | 1419517_at | 0,153724144 | 8.90755E-06 | 0.95780695 | 0,661055608 | ||
| Harakiri, BCL2 interagierende Protein (enthält nur BH3-Domäne) | BQ175572 | 1439854_at | 0,154284407 | 2.0118E-05 | 0.56516812 | 4.86925E-09 | ||
| Kohlenhydrat-(N-Acetyl 4-0) Sulfotransferase 9 | AK017407 | 1431897_at | 0,155238951 | 5.37423E-06 | 1.14910007 | 0,215637733 | ||
| Calpain 3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0,160871988 | 1.07655E-05 | 0,477164757 | 1.33753E-11 | ||
| Zink-Finger, CCHC Domäne mit 5 | BQ126004 | 1437355_at | 0,161812078 | 3.08262E-06 | 0,421252632 | 0.01152969 | ||
| Loricrin | NM_008508 | 1448745_s_at | 0,165129967 | 1.86362E-05 | 0,639733409 | 0,000729772 | ||
| spondin 1, (f-spondin) der extrazellulären Matrix Protein | BC020531 | 1451342_at | 0,168035879 | 6.67867E-07 | 0,821042412 | 0,023650765 | ||
| RIKEN cDNA A930035E12 Gen | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E-07 | 1,470383201 | 0,104085454 | ||
| BB247294 RIKEN in voller Länge angereichert, 7 Tage die Neugeborenen Kleinhirn Mus musculus cDNA-Klon A730018G18 3 ', mRNA-Sequenz. | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E-05 | 1,968147585 | 0.00010636 | ||
| FERM Domäne mit 3 | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0,000345581 | 2,780297178 | 1.83072E-06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E-06 | 2,652516957 | 0,000206279 | |||
| Transkribiert Sequenzen | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E-06 | 1,296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1, (f-spondin) der extrazellulären Matrix Protein | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E-06 | 0,836181248 | 0,001380141 | ||
| Calbindin-28K | BB246032 | 1448738_at | 0,180317904 | 1.35961E-05 | 0,647334052 | 4.12268E-09 | ||
| MARCKS-like 1 | AV110584 | 1437226_x_at | 0,186235935 | 1.47067E-06 | 0,499291387 | 2.34984E-08 | ||
| Matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0,187783528 | 6.19122E-05 | 0.8967688 | 0,282337853 | ||
| Matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0,188195795 | 0,000105295 | 0,915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1, (f-spondin) der extrazellulären Matrix Protein | BQ175871 | 1442613_at | 0,189956563 | 9.41195E-06 | 0,861033222 | 0.1394266 | ||
| Arrestin 3, retinale | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E-05 | 3,944218329 | 1.07437E-07 | ||
| RIKEN cDNA A330050F15 Gen | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0,000119342 | 0,660282035 | 2.47342E-05 | ||
| Ansprechpartnerin 3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0,194404608 | 4.08641E-07 | 0,918742591 | 0,022545297 | ||
| Calbindin-28K | BB246032 | 1417504_at | 0,196381321 | 2.24182E-05 | 0,619305124 | 3.6222E-06 | ||
| Gastrin Releasing Peptide | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E-05 | 2,752845903 | 5.72954E-07 | ||
| Sortilin-bezogene VPS10 domain containing receptor 3 | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E-05 | 1.29051599 | 0,029733649 | ||
| Dopamin-Rezeptor-D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E-05 | 1,815881979 | 0,000516498 | ||
| Proproteinkonvertase Subtilisin / kexin Typ 5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0,210528027 | 7.83039E-05 | 0,574126078 | 9.15496E-05 | ||
| Interleukin-1 Rezeptor Typ I | NM_008362 | 1448950_at | 0,210572243 | 9.64524E-06 | 0,241135352 | 2.79816E-08 | ||
Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Guide für Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, und von der Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss bei Fujita Health University.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Yoko Nabeshima an der Kyoto University für ihren Unterricht auf der Dissektionstechnik und Frau Aki Miyakawa bei Fujita Health der Universität für ihre Unterstützung zu filmen. Von MEXT in Japan, und durch - Diese Arbeit wurde durch das Programm zur Förderung der Grundrechte Studies in Health Sciences der National Institute of Biomedical Innovation, ein Grant-in-Aid for Scientific Research auf Schwerpunktbereiche-Integrative Hirnforschung (Shien) unterstützt Grant-in-Aid von CREST der Japan Science and Technology Agency.
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