Summary
実体顕微鏡下で成体マウスから海馬歯状回の除去のための解剖手法は、このビデオに記録されたプロトコルで実証された。
Abstract
海馬は、メモリの処理と学習におけるその重要な機能的役割、その顕著な神経細胞の可塑性、およびてんかんへの関与、神経変性疾患、精神疾患の脳内で最も広く研究されている地域の一つです。海馬は、明確な領域で構成され、主に顆粒ニューロン、および主に錐体細胞を含み、アモンの角、、と二つの領域を含み、歯状回は、解剖学的および機能的な回路の両方で接続されています。多くの異なるmRNAとタンパク質が選択的に海馬歯状回に発現しており、歯状回では、成体のニューロン新生のサイトですされ、つまり、新しいニューロンは継続的に成人歯状回で生成されます。歯状回への特定のmRNAとタンパク質発現を調べるために、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションが用いられることが多い。このメソッドは、そのような特別な装置や複雑な処理手順の必要性として、しかし、いくつかの制限があります。このビデオに記録されたプロトコルでは、我々は実体顕微鏡下で成体マウスから海馬歯状回を削除するための解剖手法を示しています。この手法を用いて調製した海馬歯状回のサンプルでは、トランスクリプトームプロテオーム、細胞生物学の分析を含む、任意のアッセイに適しています。我々は、解剖組織は、トリプトファン2,3 - ジオキシゲナーゼ（TDO2）とデスモプラキン（DSP）、およびアモンの角に富んだ遺伝子、メイス関連遺伝子型1b（Mrg1b、歯状回特異的遺伝子のリアルタイムPCRを行うことにより、歯状回であることを確認）とTYRO3タンパク質チロシンキナーゼ3（Tyro3）。 Mrg1bとTyro3はアモンの角の試料のものよりも、低いレベルであったのに対し、歯状回のサンプルでTDO2とDSPのmRNA発現は、明らかに高いレベルで検出された。この方法の利点を実証するために、我々は全体の海馬と歯状回のサンプルを使用して、DNAマイクロアレイ解析を行った。 α- CaMKII + /の全体の海馬では、歯状回で選択的に発現しているTDO2とDSPのmRNA発現、 - マウスは、それぞれ0.037および野生型マウスのそれに比べて0.10倍の変化を、示した。孤立歯状回では、しかしながら、これらの式は、より高い感度で検出することができる歯状回におけるその遺伝子発現の変化を示す、0.011と野生型マウスのそれに比べて0.021倍の変化を示した。一緒になって、この便利で正確な解剖の技術は確実に歯状回に焦点を当てた研究にも使用できます。
Protocol
海馬歯状回の解剖
- 深く麻酔マウスでは、慎重に頭蓋骨から脳を摘出し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に配置します。
- 氷冷したPBSを含むペトリ皿に、メスを用いて大脳縦裂に沿って脳を切断し、ラムダ（中脳、後脳、小脳）の後方の領域を切り取ります。
- 大脳半球の内側面を上に配置し、鉗子を使用して、慎重に解剖顕微鏡下で間脳（視床と視床下部）を取り外します。これは、歯状回の可視化を可能にする、海馬の内側を公開します。歯状回では、それらの間のギャップによってアモンの角から区別される。海馬や周辺地域への損傷は、それがより困難に海馬歯状回を分離することになります。
- 歯状回（歯状回とアンモン角の境界、図1）の両側に鋭い針先（例えば、27ゲージの針を）挿入し、隔離する海馬のsepto - 時間軸に沿って表面的に針をスライドさせ歯状回。
- 針やピンセットを使用して分離海馬歯状回をピックアップし、サンプル管に入れてください。得られた歯状回の組織サンプルは、任意のアッセイのために直ちに使用するか、後で使用するための深い冷凍庫に保存することができます。
- 同じ方法を使用して他の大脳半球から海馬歯状回を分離する。
定量的リアルタイムPCR
歯状回は、上記の方法を用いて単離され、残りの海馬は、野生型マウスからアモンのホーンのサンプルとして解剖した。 β-アクチン、TDO2、DSP、Mrg1bとTyro3のリアルタイムPCRは、以前は次の1に記載のように海馬歯状回とアンモン角の試料を用いて行われた。プライマー5' - CTGGCGAGATCACGATGACGと5' - AAGCTACGCTGTTGTCTAACCはTyro3ためMrg1b、およびGCCTCCAAATTGCCCGTCAと5' - CCAGCACTGGTACATGAGATCAのために使用されていました。
マイクロアレイ解析
（ -マウスα- CaMKII + /）前述1に記載マイクロアレイ実験は、雄の野生型マウスとカルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIのα-アイソフォームのためのヘテロ接合体マウスを用いて行った。簡単に言えば、全体海馬または野生型と変異マウスの海馬歯状回から単離されたRNAは、マウスゲノム430 2.0アレイ（Affymetrix社、サンタクララ、カリフォルニア州）とハイブリダイズさせた、とそれぞれのGeneChipはアフィメトリクスGeneChipスキャナー3000（GCS3000）によってスキャンされた。 GeneChip解析は、マイクロアレイ解析スイートバージョン5.0で実施した。
Discussion
歯状回は海馬体2,3の容積の約25％〜30％を占めている。それは、ユニークな細胞組成を有し、様々な脳機能において重要な役割を果たしている。したがって、歯状回を分離する技術は、この地域で特に発生するイベントを分析するのに便利です。
ここで、我々は効率的に成体マウスの海馬から海馬歯状回を分析する手順を明らかにし、技術の精度を確認した。最初に、組織学的研究は、歯状回は、純粋な歯状回のサンプルが準備できることを示す、他の地域で汚染（図1）に分離していることが判明した。
第二に、我々は、解剖組織は、歯状回特異的遺伝子、TDO2やDSP、そしてアモンの角に富んだ遺伝子、Mrg1bとTyro3 4（図2）のリアルタイムPCRを行うことにより、歯状回であることを確認した。 TDO2のmRNA発現（P = 0.000023であり、nの= 4、4、それぞれ）とDSP（P = 0.0000030; nのそれぞれ= 4、4、）歯状回のサンプルでは、明らかに高いレベルで検出されたのに対し、Mrg1b（P = 0.000080であり、nの= 4、4、それぞれ）とTyro3（P = 0.00017、nのそれぞれ= 4と4は、）アモンの角の試料のものよりも、低いレベルであった。 （; Nの= 4と4、 それぞれ 、p = 0.11）β-アクチンの発現レベルは、これらのサンプルでは差は認められなかった。従って、我々は、海馬歯状回が正確にこのような単純なリアルタイムPCR実験を行うことにより、外切開されたかどうかをチェックすることもできます。
この解剖法の有用性を評価するために、第三に、我々は、海馬歯状回のように全体の海馬のmRNA発現レベルを比較した。マウス（それぞれnの= 18、4、）マイクロアレイ解析のために処理され、すべての遺伝子が得点のために、フォールド - 野生型（Nの= 9、4、それぞれ）とα- CaMKII + /は、から得られる全体の海馬と歯状回変更は、野生型の値によって変異体値で割ることにより算出した。結果は、特にそのようなDSPとTDO2などの歯状回、特定の分子のmRNA発現の変化が、、全体の海馬サンプル（表1）と比較して歯状回の試料で感度が5倍に増加すると、最大検出されたことが示された。このようなワーキングメモリの赤字と誇張されたinfradianリズム1,5のような人間の精神疾患に関連したマウスの展示行動-我々は以前にα- CaMKII + /ことを示した。さらに、変異マウスの海馬歯状回の神経細胞の形態学的および電気生理学的特徴は、これらの変異マウスの神経細胞が成熟1に開発するために失敗したことを示す、通常のげっ歯類の未成熟歯状回の神経細胞のそれらと非常に似ています。未熟な歯状回とダウンレギュレートDSPの発現とα- CaMKIIのTDO2 mRNAは、+ / - マウスでは、DSPとTDO2は歯状回（大平らに成熟顆粒細胞のマーカーとして使用することができるという知見と一致している、未発表。データ）。
一緒になって、この便利で正確な解剖の技術は確実に歯状回に焦点を当てた研究にも使用できます。この方法を用いて得られた歯状回の組織では、プロテオミクス、細胞生物学の分析を含むだけでなく、分析の他のタイプに適用可能である。
図1組織学的研究により、孤立歯状回の検証。歯状回を分離後の脳の冠状断面をニッスル染色（左パネル）のために処理、およびマウスの脳atlas6から適応の模式図は、左側のパネル（右パネル）に示すようにセクションのほぼ同じレベルを表していた。矢印は針先端の挿入の方向を示している。スケールバーは1mm。
図2リアルタイムPCRにより単離した海馬歯状回の検証。 four野生型マウスから得られた海馬歯状回とアンモンの角はβ-アクチン、TDO2、DSP、Mrg1bとTyro3のリアルタイムPCRのために処理した。結果は平均± SEMとして表示されます。統計分析のために、学生のt検定が用いられた、とp値が続いている：β-アクチン、P = 0.11; TDO2、P = 0.000023（** 1）、DSP、P = 0.0000030（** 2）; Mrg1b、P = 0.000080（** 3）、及びTyro3、P = 0.00017（** 4）。
表1。 。全体の海馬と歯状回のマイクロアレイ解析遺伝子が差α- CaMKIIの歯状回と全体の海馬で発現する+ / -マウスは野生型マウスで検出されたことから倍の変化を計算することにより決定された。マウス-データは、野生型とα- CaMKII + /の間にスチューデントの t検定を用いて統計的有意性について分析した。その発現が<0.05 の p を示した遺伝子の中でα- CaMKII + /の歯状回 - 野生型マウスのそれと比較してマウスは、トップ50の遺伝子が記載されています。歯状回のためのサンプル数が全体の海馬のものよりはるかに少ないことに注意してください。 AffyID、アフィメトリクスプローブ識別子、CKII、α- CaMKII + / - マウス、WT、野生型マウス。
| 歯状回（P <0.05） WT：N = 4、CKII + / - ：n = 4の | 全体海馬 WT：N = 9、CKII + / - ：n = 18と | |||||||
| 遺伝子のタイトル | ジーンバンク | AffyID | 倍の変化 | p値 | 倍の変化 | p値 | ||
| デスモプラキン | AV297961 | 1435494_s_at | 0.011018913 | 7.02694E - 06 | 0.037021003 | 1.86126E - 13 | ||
| デスモプラキン | AV297961 | 1435493_at | 0.014369734 | 7.86747E - 06 | 0.04232106 | 1.00579E - 12 | ||
| トリプトファン2,3 - ジオキシゲナーゼ | AI098840 | 1419093_at | 0.020986484 | 5.23546E - 09 | 0.101037776 | 4.14823E - 13 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452106_at | 0.075479901 | 1.05191E - 08 | 0.234001154 | 1.66301E - 15 | ||
| nephronectin | AA223007 | 1452107_s_at | 0.079457767 | 1.40433E - 07 | 0.177974715 | 3.9758E - 12 | ||
| 甲状腺刺激ホルモンは、ホルモン受容体をリリース | M59811 | 1449571_at | 0.103105815 | 0.003093796 | 0.801412732 | 0.283994361 | ||
| リアノジン受容体1、骨格筋 | X83932 | 1427306_at | 0.104825517 | 3.38513E - 07 | 0.650685017 | 0.000308462 | ||
| 不可知のヘリックスループヘリックス1 | NM_010916 | 1419533_at | 9.431896 | 6.7979E - 06 | 4.078815314 | 5.27E - 11 | ||
| copine家族メンバーIX | BB274531 | 1454653_at | 9.159157 | 7.99492E - 06 | 1.797304153 | 0.000296375 | ||
| doublecortinのようなキナーゼ3 | BB326709 | 1436532_at | 0.109336662 | 1.95278E - 07 | 0.56697229 | 2.62633E - 08 | ||
| カルパイン3 | AF127766 | 1426043_a_at | 0.111269769 | 8.07053E - 06 | 0.370956608 | 2.04421E - 14 | ||
| 成人男性の線条体cDNAを、理研フルレングス濃縮ライブラリ、クローン：C030023B07製品：分類できない、完全なインサート配列 | BB357628 | 1460043_at | 0.118712341 | 6.16926E - 07 | 0.682339204 | 2.33001E - 06 | ||
| コラーゲンとカルシウム結合EGFドメイン1 | AV264768 | 1437385_at | 0.124043978 | 3.65669E - 05 | 0.488394112 | 4.05538E - 06 | ||
| アミロイドベータ（A4）前駆体タンパク質結合、家族、メンバー2結合タンパク質 | AK013520 | 1431946_a_at | 7.7986307 | 1.2098E - 06 | 2.099164713 | 1.67047E - 06 | ||
| カルビンジン- 28K | BB177770 | 1456934_at | 0.130255444 | 3.32186E - 06 | 0.572605751 | 1.99157E - 10 | ||
| 転写された遺伝子座 | AV328597 | 1443322_at | 0.133290835 | 5.43583E - 06 | 0.562767164 | 7.56544E - 06 | ||
| ニューロペプチドY受容体Y2 | NM_008731 | 1417489_at | 0.135319609 | 0.000113407 | 0.781498474 | 0.00394504 | ||
| RAS応答性エレメント結合タンパク質1 | BE197381 | 1428657_at | 0.138235114 | 7.93691E - 07 | 0.651220705 | 2.94209E - 05 | ||
| アルファ2神経栄養因子ファミリーの受容体に由来グリア細胞株 | BB284482 | 1433716_x_at | 0.139062563 | 2.35371E - 06 | 0.669544709 | 0.000214146 | ||
| preproenkephalin 1 | M13227 | 1427038_at | 6.9850435 | 2.39074E - 08 | 1.766018828 | 0.000250501 | ||
| 理研cDNAを1810010H24遺伝子 | BI729991 | 1428809_at | 6.8658915 | 1.88516E - 05 | 2.77573142 | 6.81865E - 09 | ||
| リアノジン受容体1、骨格筋 | BG793713 | 1457347_at | 0.151364292 | 3.35612E - 05 | 0.503144617 | 4.32907E - 05 | ||
| プロト21 | NM_130878 | 1418304_at | 0.152671849 | 8.57783E - 06 | 0.670714726 | 1.56309E - 05 | ||
| コルニッションのホモログ3（ショウジョウバエ） | NM_028408 | 1419517_at | 0.153724144 | 8.90755E - 06 | 0.95780695 | 0.661055608 | ||
| 腹切、BCL2相互作用するタンパク質（のみBH3ドメインを含む） | BQ175572 | 1439854_at | 0.154284407 | 2.0118E - 05 | 0.56516812 | 4.86925E - 09 | ||
| 炭水化物（N -アセチルガラクトサミン4-0）硫酸転移酵素9 | AK017407 | 1431897_at | 0.155238951 | 5.37423E - 06 | 1.14910007 | 0.215637733 | ||
| カルパイン3 | AI323605 | 1433681_x_at | 0.160871988 | 1.07655E - 05 | 0.477164757 | 1.33753E - 11 | ||
| ジンクフィンガー、5を含むCCHCドメイン | BQ126004 | 1437355_at | 0.161812078 | 3.08262E - 06 | 0.421252632 | 0.01152969 | ||
| ロリクリン | NM_008508 | 1448745_s_at | 0.165129967 | 1.86362E - 05 | 0.639733409 | 0.000729772 | ||
| spondin 1、（F - spondin）細胞外マトリックスタンパク質 | BC020531 | 1451342_at | 0.168035879 | 6.67867E - 07 | 0.821042412 | 0.023650765 | ||
| 理研cDNAをA930035E12遺伝子 | AV348640 | 1429906_at | 5.9086795 | 1.747E - 07 | 1.470383201 | 0.104085454 | ||
| BB247294理研フルレングス濃縮、7日新生児小脳ハツカネズミcDNAクローンA730018G18 3'、mRNA配列。 | BB247294 | 1447907_x_at | 5.9047494 | 1.04931E - 05 | 1.968147585 | 0.00010636 | ||
| 3を含むFERMドメイン | BB099015 | 1437075_at | 5.860216 | 0.000345581 | 2.780297178 | 1.83072E - 06 | ||
| NM_016789 | 1420720_at | 5.7568517 | 1.34227E - 06 | 2.652516957 | 0.000206279 | |||
| 転写配列 | BG076361 | 1460101_at | 5.657735 | 2.5015E - 06 | 1.296248831 | 0.22870031 | ||
| spondin 1、（F - spondin）細胞外マトリックスタンパク質 | BC020531 | 1424415_s_at | 0.17783576 | 1.01658E - 06 | 0.836181248 | 0.001380141 | ||
| カルビンジン- 28K | BB246032 | 1448738_at | 0.180317904 | 1.35961E - 05 | 0.647334052 | 4.12268E - 09 | ||
| MARCKS様1 | AV110584 | 1437226_x_at | 0.186235935 | 1.47067E - 06 | 0.499291387 | 2.34984E - 08 | ||
| matrilin 2 | BB338441 | 1455978_a_at | 0.187783528 | 6.19122E - 05 | 0.8967688 | 0.282337853 | ||
| matrilin 2 | BC005429 | 1419442_at | 0.188195795 | 0.000105295 | 0.915528892 | 0.35282097 | ||
| spondin 1、（F - spondin）細胞外マトリックスタンパク質 | BQ175871 | 1442613_at | 0.189956563 | 9.41195E - 06 | 0.861033222 | 0.1394266 | ||
| アレスチン3、網膜 | NM_133205 | 1450329_a_at | 5.2130346 | 2.90599E - 05 | 3.944218329 | 1.07437E - 07 | ||
| 理研cDNAをA330050F15遺伝子 | AV325555 | 1457558_at | 0.19186781 | 0.000119342 | 0.660282035 | 2.47342E - 05 | ||
| コンタクチン3 | BB559510 | 1438628_x_at | 0.194404608 | 4.08641E - 07 | 0.918742591 | 0.022545297 | ||
| カルビンジン- 28K | BB246032 | 1417504_at | 0.196381321 | 2.24182E - 05 | 0.619305124 | 3.6222E - 06 | ||
| ガストリン放出ペプチド | BC024515 | 1424525_at | 4.9436426 | 3.00588E - 05 | 2.752845903 | 5.72954E - 07 | ||
| 受容体3を含むソルチリン関連VPS10ドメイン | AK018111 | 1425111_at | 4.885766 | 1.03645E - 05 | 1.29051599 | 0.029733649 | ||
| ドーパミン受容体D1A | BE957273 | 1455629_at | 4.869493 | 3.77525E - 05 | 1.815881979 | 0.000516498 | ||
| 前駆タンパク質転換酵素サブチリシン/科新タイプ5 | BB241731 | 1437339_s_at | 0.210528027 | 7.83039E - 05 | 0.574126078 | 9.15496E - 05 | ||
| インターロイキン1受容体は、私のように入力します | NM_008362 | 1448950_at | 0.210572243 | 9.64524E - 06 | 0.241135352 | 2.79816E - 08 | ||
Disclosures
動物実験は、ケアと実験動物の使用のための健康ガイドの国立研究所にしたがって行われ、藤田保健大学で動物のケアと使用に関する委員会によって承認された。
Acknowledgments
私たちは、映画への彼女のサポートのための解剖手法と藤田保健大学亜紀宮川の彼女の命令のために京都大学で博士陽子鍋島に感謝。日本の文部科学省から、とで - この作品は、医薬基盤、優先エリア - 統合脳研究（Shien）科学研究費補助金の国立研究所の健康科学の基礎的研究の推進のためのプログラムによってサポートされていました日本科学技術振興機構のCRESTからの補助金。
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