Vi visar protokollet för generering av inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga somatiska celler med lentivirus-medierade leverans av mänskliga faktorer Oct4, Sox2, NANOG och Lin28. Pluripotens bekräftades av morfologi och förekomst av embryonala stamceller (ES) cell-specifika markörer.
Under 2006 Yamanaka och kollegor först visade att retrovirus-medierad leverans och uttryck Oct4, Sox2, c-Myc och Klf4 kan förmå pluripotenta staten i musfibroblaster. 1 Samma grupp rapporterade också den framgångsrika omprogrammering av mänskliga somatiska celler in inducerade pluripotenta stamceller (IPS) celler använder mänskliga versioner av samma transkriptionsfaktorer som levereras av retrovirala vektorer. 2 Dessutom James Thomson et al. rapporterade att lentivirus-medierad co-uttryck för en annan uppsättning faktorer Oct4 (, Sox2, NANOG och Lin28 ) kunde omprogrammering mänskliga somatiska celler till iPS-celler. 3
iPS-celler liknar ES-celler i morfologi, spridning och möjligheten att differentiera till alla typer av vävnad i kroppen. Mänskliga iPS-celler har en klar fördel framför ES-celler som de uppvisar viktiga egenskaper hos ES-celler utan det etiska dilemmat av embryon förstörs. Den generation av patient-specifika iPS-celler kringgår en viktig vägspärr till personliga regenerativ medicin terapier genom att eliminera risken för avstötning av icke-autologa transplanterade celler.
Här kan vi visa protokollet för omprogrammering mänskliga fibroblast celler med Stemgent mänskliga TF lentivirus Set. Vi visar också att celler omprogrammeras med denna uppsättning börja visa iPS morfologi fyra dagar efter transduktion. Använda Stemolecule Y27632 valde vi för iPS-celler och observerade korrekta morfologi efter tre sekventiella rundor av koloni plockning och passaging. Vi visar också att efter omprogrammering celler visas de pluripotens markör AP, yta markörer TRA-1-81 TRA-1-60, SSEA-4 och SSEA-3, och nukleära markörer Oct4, Sox2 och NANOG.
Dessa resultat visar att Stemgent mänskliga TF lentivirus set kan användas för att effektivt skapa iPS kolonierna genom att inducera den ektopisk uttryck för transduced transkriptionsfaktorer i mänskliga fibroblaster. Vid utformningen av omprogrammering experiment bör flera variabler anses optimera effektiviteten i programplaneringen. Det första kan aktivt virus-to-target förhållande (mångfald av infektion MOI) måste ändras under den primära transduktion steg för att uppnå optimal transduktion effektivitet. För det andra kan tillväxten skick målceller påverkan omprogrammering. Friska och proliferativa celler är mer mottagliga för omprogrammering. Det tredje, när du ändrar protokollet för olika cell nummer, rekommenderas att målcellen siffror justeras i proportion till ytan av kulturen skålen. Slutligen bör tillämpa ROCK-hämmare som Y27632 anses bidra till en framgångsrik omprogrammering eftersom nya studier har visat sin nytta i att öka hES koloni överlevnad. 4,5
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | ||
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | ||
TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | ||
TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | ||
SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | ||
SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |