Summary
אנו מדגימים את פרוטוקול עבור הדור של המושרה בתאי גזע pluripotent מן האדם תאים סומטיים באמצעות lentivirus בתיווך המסירה של גורמים אנושיים Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. Pluripotency אושרה על ידי המורפולוגיה ואת הנוכחות של גזע עובריים (ES) סמנים ספציפיים התא.
Abstract
בשנת 2006, יאמאנאקה ועמיתיו הוכיחו הראשון רטרווירוס בתיווך מסירה ביטוי Oct4, Sox2, c-myc ו Klf4 מסוגל גרימת המדינה pluripotent ב fibroblasts העכבר. 1 אותה קבוצה גם דיווחו על תכנות מחדש מוצלח של אדם לתוך תאים סומטיים המושרה גזע pluripotent (IPS) תאים באמצעות גירסאות האדם של גורמי תעתוק אותו מועברים על ידי וקטורים retroviral. 2 בנוסף, ג'יימס תומסון et al. דיווחו כי lentivirus בתיווך שיתוף הביטוי של קבוצה נוספת של גורמים (Oct4, Sox2, Nanog ו Lin28 ) היה מסוגל reprogramming האדם תאים סומטיים לתאי iPS 3.
תאים iPS דומים לתאי גזע עובריים בהפצה מורפולוגיה, ואת היכולת להתמיין לכל סוגי הרקמות בגוף. האדם תאים iPS יש יתרון בולט על פני תאים ES כפי שהם מציגים תכונות מפתח של תאים ES ללא הדילמה האתית של הרס העובר. הדור של מטופל ספציפי בתאי iPS עוקף מחסום חשוב אישית טיפולים רפואה רגנרטיבית ידי ביטול פוטנציאל דחייה של מערכת החיסון הלא עצמיים התאים המושתלים.
כאן אנו מדגימים את פרוטוקול תכנות מחדש תאים פיברובלסטים אנושי באמצעות הגדרת Stemgent האדם TF Lentivirus. כמו כן, אנו מראים כי תאים reprogrammed עם סט זה מתחיל להראות iPS מורפולוגיה ארבעה ימים לאחר התמרה. שימוש Y27632 Stemolecule, בחרנו עבור תאים iPS ומורפולוגיה לתקן נצפה לאחר שלושה סיבובים רציפים של המושבה קטיף ואת passaging. כמו כן, אנו מראים כי תאים לאחר תכנות מחדש מוצגת בסמן AP pluripotency, סמנים משטח tra-1-81, tra-1-60, SSEA-4 ו SSEA-3, ו סמנים גרעיני Oct4, Sox2 ו Nanog.
Protocol
1. תכנות מחדש
- ב"ג Seed תאים בצפיפות של 1 x 10 5 תאים לכל גם צלחת 6 באר. התרבות התאים 2 מ"ל של מדיום הגידול (450 מ"ל EMEM בתוספת 50 מ"ל ES FBS מוסמך, 5 מ"ל 10 mM שאינם חיוניים חומצות אמינו, 5 מ"ל פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מ"ל 200 מ"מ L-גלוטמין ו - 0.9 ml 55 β mM -mercaptoethanol) לילה ב 37 ° C ו 5% CO 2.
- באותו יום, להתחיל בהכנת צלחות MEF מזין ידי הוספת 0.1% ג'לטין מדולל במים לצלחת 6 היטב דוגרים לילה בשעה 37 ° C ו-CO 2 של 5%.
- לאחר דגירה, להסיר בינוני מתאי ב"ג ומוסיפים 2 מ"ל צמיחה בינוני בתוספת 6 מיקרוגרם / מ"ל של polybrene, 500 μl hOct4-lentivirus, 50 μl hSox2-lentivirus, 50 μl hNanog-lentivirus ו 50 μl hLin28-lentivirus זה טוב . רוק בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ציפוי אפילו של המדיום. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
- באותו יום, להסיר 1 בקבוקון של תאים CF-1 MEF מ חנקן נוזלי ההפשרה. הסרת נוזל מבארות מצופה ג'לטין (ראה שלב 1.2) ולהוסיף מזין תאים MEF בצפיפות של 0.2 x 10 5 תאים / היטב. ההיקף הכולל לכל טוב צריך להיות 2ml של תאים במדיום הגידול MEF (450 מ"ל DMEM בתוספת 50 מ"ל ו 5 מ"ל FBS שאינם חיוניים חומצות אמינו).
- למחרת, לנתק תאים ב"ג עם 0.05% טריפסין / EDTA ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב הבינוני resuspend במדיום הגידול. הסר בינוני מהצלחת מזין MEF (ראה שלב 1.4) ומוסיפים 2 מ"ל / היטב ההשעיה תא ב"ג. ריכוז התאים יש כ 5 x 10 4 תאים / היטב. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
- החלף בינוני 24 שעות לאחר זריעה מחדש עם אדם בינוני ES / תא iPS תרבות (400 מ"ל DMEM/F12 בתוספת החלפת נוק סרום 100 מ"ל, 10 מ"ל 5 שאינם חיוניים mM חומצות אמינו, 5 מ"ל 200 מ"מ L-גלוטמין, 0.9 מ"ל 55 מ"מ ו - β-mercaptoethanol 20 ng / ml bFGF רקומביננטי אנושי). שנה בינונית כל 24 שעות למשך 7 ימים.
- לאחר שבעה ימים, לשנות בינוני עד בינוני MEF מותנה (ראה סעיף 2).
2. הכנת בינוני MEF אילף
- זרעים CF-1 מזין MEF תאים ב 2 x 10 5 תאים / גם בצלחת 6 באר בינוני 2 הצמיחה MEF מ"ל. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
- שינוי בינוני עד בינוני אדם ES / iPS תרבית תאים. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
- איסוף supernatant כל 24 שעות במשך ארבעה ימים. סינון supernatant דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
- מוסף supernatant עם 50 ng / ml של bFGF.
3. iPS לבחירה קולוני ו Passaging
- בחר המושבה ES-כמו מחדש זרע בינוני ES / iPS האדם תרבות בתוספת של 10 מיקרומטר Stemolecule Y27632 על התרבות תאים טרום מנות זרע עם CF-1 תאים מזין MEF. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO 2.
- שינוי התרבות בינוני כל 24 שעות למשך שבעת הימים הראשונים (בלי להשלים עם Stemolecule Y27632). לאחר שבעה ימים, לשנות בינוני עד בינוני MEF מותנה (ראה סעיף 2 להכנת). המשכנו passaging התאים עד שהם הראו ES טיפוסי מורפולוגיה האדם.
4. בחינת Immunocytochemical של סמנים pluripotency
- לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.
- תקן את התאים עם 500 μl של מקבע במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.
- בלוק הלא ספציפית מחייב עם חיץ 500 μl חסימת שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- דגירה התאים עם 250 μl של הנוגדן העיקרי ספציפי לילה ב 4 ° C (השתמשנו tra-1-81, tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, Oct4, Sox2, Nanog ו Lin28 בשעה 1:100 דילולים).
- לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.
- דגירה התאים עם 250 μl של נוגדנים משני שעה 1 בטמפרטורת החדר, שמירה מן האור (השתמשנו עיזים אנטי עכבר IgM Cy3 המצומד, עיזים אנטי עכבר IgG Cy3 המצומד, אנטי עכברוש עיזים IgM Cy3 המצומד ו עיזים אנטי הארנב Cy3 המצומד בשעה 1:300 דילולים).
- לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם PBS.
- הוסף DAPI (הריכוז הסופי 1 מיקרוגרם / מ"ל) לשטוף האחרון דגירה 5 דקות כדי להמחיש גרעינים.
- נתח את התאים בהגדלה.
חלק 5: תוצאות נציג
1. מורפולוגיה תוצאות:
האדם פיברובלסטים העורלה (ב"ג) היו תאים שיתוף transduced עם Oct4, Sox2, Nanog, ו Lin28. שינויים מורפולוגיים נצפו כבר ביום שלאחר 4 התמרה, ואת מקבץ של תאים נהיו יותר צפופים בכל יום 17 (איור 1). מושבות נבחרו באופן ידני בכל יום 25 ותרבותי על CF-1 תאים MEF מזין. כדי להקל את המושבה תא iPS היווצרות לאחר תכנות מחדש, השתמשנו Stemolecule Y27632, מעכב רוק, על זריעת לילה ראשונית במהלך כל קטע. מושבות iPS תא עם מורפולוגיה טובה נצפו לאחר שלושה סיבובים רציפים של המושבה קטיף ואת passaging.
2. הביטוי של סמנים pluripotency:
כדי להמשיך ולאפיין את iPS מושבות תאים מבודדים, חיפשנו נוכחותם של סמנים pluripotency המשותף לידי ביטוי בתאי גזע עובריים. מושבות הציג חזק phosphatase אלקליין (AP) פעילות (איור 2). בנוסף, immunocytochemistry (ICC) בוצע על מושבות תאים iPS עם פאנל של נוגדנים ספציפיים סמן pluripotency, כולל סמנים משטח tra-1-81, tra-1-60, SSEA-4 ו SSEA-3, כמו גם סמנים גרעיני Oct4, Sox2 ו Nanog. מושבות מבודדות iPS היו חיוביות עבור כל הסמנים (איור 3). תוצאות ICC מראים כי תאים iPS הציג את הביטוי המתאים pluripotency דפוס סמן, הוכחת כי תאים אלה iPS דומים שלא עברו התמיינות תאים עובריים אנושיים.
איור 1: שינויים מורפולוגיים של transduced תאים ב"ג. תמונות שדה מוארת של מושבה iPS טיפוסי תא נוצר ב (א) 4 ימים (ב) התמרה שלאחר 17 ימים.
איור 2: איי פי הפעילות של תאים ב"ג reprogrammed. שלוש מושבות שונות מוכתם Stemgent ערכת phosphatase אלקליין מכתים.
איור 3: אדם בתאי iPS להביע רמות גבוהות של התא הבא ES סמנים ספציפיים: סמנים משטח tra-1-81, tra-1-60, SSEA-4 ו SSEA-3, ו סמנים גרעיני אוקטובר 4, Nanog ו Sox2.
Discussion
תוצאות אלו מראות כי הגדר Stemgent האדם TF Lentivirus ניתן להשתמש ביעילות ליצור מושבות iPS ידי גרימת ביטוי אקטופי של transduced גורמי שעתוק ב fibroblasts האדם. בעת תכנון ניסויים תכנות מחדש, כמה משתנים צריך להיחשב כדי לייעל את היעילות של תכנות מחדש. ראשית, יחס פעיל וירוס אל היעד (ריבוי הפנים של זיהום) ייתכן שיהיה צורך לשנות במהלך השלב הראשוני התמרה התמרה כדי להשיג יעילות אופטימלית. שנית, בתנאי הגידול של התאים היעד יכול להשפיע על תכנות מחדש. תאים בריאים שגשוג הנוחות יותר תכנות מחדש. שלישית, כאשר משנים את הפרוטוקול למספרים תאים שונים, מומלץ כי התא מספרי היעד להיות מותאם באופן יחסי על פני השטח של המנה תרבות. לבסוף, מעכבי ROCK יישום כגון Y27632 צריך להיחשב כדי להבטיח reprogramming מוצלח כמו מחקרים שנעשו לאחרונה הראו השירות שלה בהישרדות הס שיפור המושבה. 4,5
Disclosures
המחברים של מאמר זה מועסקים על ידי Stemgent המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | |
| Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
| TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | |
| TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | |
| SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | |
| SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I. I., Thompson, J. A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (1917).
- Watanabe, K., Ueno, M., Kamiya, D., Nishiyama, A., Matsumura, M., Wataya, T., Takahashi, J. B., Nishikawa, S., Muguruma, K., Sasai, Y. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Koyanagi, M., Takahashi, J., Arakawa, Y., Doi, D., Fukuda, H., Hayashi, H., Narumiya, S., Hashimoto, N. Inhibition of the Rho/ROCK pathway reduces apoptosis during transplantation of embryonic stem cell-derived neural precursors. J. Neurosci. Res. 86, 270-280 (2008).
