Aortica Anello Assay

Summary

Angiogenesi, il germogliare dei vasi sanguigni da vasi preesistenti, è associata ad entrambi i processi naturali e patologici. Qui mostriamo un saggio aortica anello che consente di potenziatori angiogenico e inibitori di essere direttamente aggiunto al anelli aortica nella cultura. Germinazione e escrescenza neovessel può essere determinato esaminando gli anelli aortica per un periodo di 6-12 giorni.

Abstract

Angiogenesi, il germogliare dei vasi sanguigni da vasi preesistenti è associato sia con i processi naturali e patologici. Vari saggi di angiogenesi riguardano lo studio delle singole cellule endoteliali in condizioni di coltura (1). Il test anello aortico è un modello di angiogenesi che si basa sulla cultura degli organi. In questo saggio, i vasi angiogenici crescere da un segmento di aorta (modificato da (2)). In breve, aorta toracica del mouse è asportato lo strato di grasso e avventizia vengono rimossi, e gli anelli di circa 1 mm di lunghezza sono preparati. Singoli anelli vengono poi integrati in una piccola cupola di estratto solido basamento matrice (BME), gettato dentro i pozzi individuale di un 48-pozzetti. Fattori angiogenetici e inibitori di angiogenesi può essere aggiunto direttamente agli anelli, e un misto co-coltura di anelli aortica e altri tipi di cellule possono essere impiegate per lo studio di effetti paracrini angiogenici. Cavolo è osservato da ispezione allo stereomicroscopio per un periodo di 6-12 giorni. A causa della grande variazione causata dal irregolarità nei segmenti aortica, la sperimentazione in 6-plicates è fortemente consigliato. Escrescenza Neovessel sia verificata durante l'esperimento e ripreso usando la microscopia di fase, e surnatanti sono raccolti per la misura dei relativi fattori angiogenici e anti-angiogenici, marcatori di morte cellulare e nitriti.

Protocol

Un giorno prima l'esperimento:

1. Lasciare BME (fattore di crescita ridotta, Cultrex, Trevigen) per scongelare il ghiaccio o a 4 ° C, una volta scongelati tenere sul ghiaccio per evitare ri-solidificazione.

Giorno dell'esperimento:

1. Topi (6-7 settimane di età) devono essere anestetizzati e dissanguato.
2. Rimuovere dell'aorta toracica in una capsula di Petri piena di freddo PBS sterile.
3. Effettuare la pulizia meccanica da tessuto adiposo circostante. Si noti, evitare l'essiccazione della aorta in qualsiasi momento.
4. Utilizzando una lama chirurgica, fetta Aorta uniformemente in 1 anelli mm. Il taglio deve essere uniforme e pulito.
5. Trasferimento anelli fresca PBS freddo e tenere su ghiaccio in ogni momento.
6. Utilizzando pre-raffreddata puntali, aggiungere in ciascun pozzetto in un 48-pozzetti una goccia rotonda di 150 ml BME freddo. Lasciare che il calo BME a solidificare a 37 ° C per 20-30 minuti.
7. Posizionare un singolo anello aortico in alto al centro di ogni cupola. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
8. In cima a ogni anello aggiungere un ulteriore BME 150 ml. Incubare per 20-30 minuti a 37 ° C.
9. Preparare medio: Human endoteliale media i livelli di free (GIBCO, Carlsbad, CA) integrato con il 2% FCS, 50 unità / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina (Cellgro).
10. Per ogni pozzetto aggiungere 500 ml di mezzo contenente sia:
    1. Campioni sperimentali.
    2. Controllo positivo: la crescita delle cellule endoteliali supplemento (ECG, concentrazione finale di 200 mg / ml, BD Biosciences).
    3. Controllo negativo: Medio soli.
11. Incubare la piastra a 37 ° C per 12 giorni, gli anelli di fotografia tra i giorni 6 e 12 sotto stereoscopio normale contrasto di fase.
12. Opzionale: Raccogliere surnatanti.

Note:

1. Mantenere condizioni sterili in ogni momento.
2. Evitare di introdurre bollicine nel BME.

Discussion

Saggio dell'anello aortico è uno strumento utile per il modo di valutare angiogenico e anti-angiogenici fattori. I vasi che crescono fuori dalla aortica anelli di reclutare cellule muscolari lisce e periciti di associare con il tubo delle cellule endoteliali, nel senso che sono anatomicamente simili a neovessels in vivo. Inoltre, il saggio topo aortica anello tiene il vantaggio della vasta gamma di strumenti transgenici disponibili per questa specie. Eppure, ci sono diversi svantaggi per il test dell'anello aortico. In primo luogo, escrescenza vasi in vivo si verifica da microvasi e non da grossi vasi come l'aorta. In secondo luogo, l'incoerenza nella gestione degli anelli e la quantità di tessuto circostante rimanendo sulla nave possono influenzare escrescenza nave. Anelli da aorte diversi o epoche diversi tipi di mouse e ceppi possono interferire con le risposte angiogenico. E, infine, escrescenza nave angiogenici si verifica in tre dimensioni, che lo rende non ideale per fotografare e quantificare. Nel loro insieme, se eseguita con sufficiente controlli interni e con repliche multiple, questo saggio è relativamente semplice, non costoso, altamente informativo e significativamente superiore a culture endoteliale nella sua complessità biologica e rilevanza.