Aórtica Assay Anel

Summary

Angiogênese, o surgimento de vasos sanguíneos da vasculatura pré-existentes, está associado a ambos os processos naturais e patológicas. Aqui demonstramos um ensaio anel aórtico que permite potenciadores e inibidores angiogênicos para ser adicionado diretamente anéis de aorta na cultura. Brotação e crescimento Neovaso formado pode ser determinada por inspeção dos anéis da aorta durante um período de 6-12 dias.

Abstract

Angiogênese, o surgimento de vasos sanguíneos da vasculatura preexistente está associada a ambos os processos naturais e patológicas. Ensaios de angiogênese vários envolvem o estudo do indivíduo células endoteliais em condições de cultura (1). O ensaio de anel aórtico é um modelo de angiogênese, que é baseada na cultura de órgãos. Neste ensaio, os vasos angiogênico crescer a partir de um segmento da aorta (modificado de (2)). Brevemente, mouse aorta torácica é extirpado, a camada de gordura e adventícia são removidos, e os anéis de aproximadamente 1 mm de comprimento estão preparados. Anéis individuais são, então, incorporado em uma pequena cúpula sólida do extrato cave matriz (BME), lança no interior de poços individuais de uma placa de 48 poços. Fatores angiogênicos e inibidores da angiogênese pode ser adicionado diretamente aos anéis, e uma mistura co-cultivo de anéis de aorta e outros tipos celulares podem ser empregadas para o estudo dos efeitos parácrinos angiogênico. Germinação é observado por inspeção sob um estereomicroscópio por um período de 6-12 dias. Devido à grande variação causada pelas irregularidades nos segmentos da aorta, a experimentação em 6-plicates é altamente recomendável. Conseqüência Neovaso formado é monitorado durante todo o experimento e fotografada por microscopia de fase, e sobrenadantes são coletadas para a medição de relevantes fatores angiogênicos e anti-angiogênico, marcadores de morte celular e nitrito.

Protocol

Um dia antes do experimento:

1. Permitir BME (fator de crescimento reduzido, Cultrex, Trevigen) para descongelar em gelo ou a 4 ° C, uma vez descongelado manter no gelo para evitar re-solidificação.

Dia do experimento:

1. Camundongos (6-7 semanas de idade) devem ser anestesiados e sangrado.
2. Remover da aorta torácica em uma placa de Petri cheia de frio estéril PBS.
3. Realizar limpeza mecânica do tecido circundante gordura. Note, evitar a secagem da Aorta a qualquer momento.
4. Usando uma lâmina cirúrgica, uma fatia de Aorta uniformemente em uma anéis mm. O corte deve ser uniforme e limpo.
5. Transferência de anéis para limpa e fria PBS e manter em gelo em todos os momentos.
6. Usando dicas pré-refrigeração pipeta, adicione a cada poço em um prato de 48 uma queda bem arredondado de 150 ml BME frio. Permitir a queda BME para solidificar a 37 ° C por 20-30 minutos.
7. Coloque um anel aórtico única no centro da parte superior de cada cúpula. Incubar por 10 minutos a 37 ° C.
8. No topo de cada anel adicionar um adicional de 150 ml BME. Incubar durante 20-30 minutos a 37 ° C.
9. Prepare médio: Human médio soro endotelial livre (GIBCO, Carlsbad, CA), suplementado com FCS a 2%, 50 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 50 mg / ml (Cellgro).
10. A cada poço adicionar 500 ml de meio contendo um ou outro:
    1. Amostras experimentais.
    2. Controlo positivo: suplemento de crescimento endotelial celular (ECGS, concentração final 200 mg / ml, BD Biosciences).
    3. Controle negativo: Médio sozinho.
11. Placa de incubar a 37 ° C por 12 dias, os anéis de fotografia entre os dias 6 e 12 sob estereoscópio padrão de contraste de fase.
12. Opcional: Colete sobrenadantes.

Notas:

1. Manter condições estéreis em todos os momentos.
2. Evitar a introdução de bolhas no BME.

Discussion

Aórtica ensaio de anel é uma ferramenta benéfica sobre a maneira de avaliar angiogênico, bem como anti-angiogênico fatores. Os vasos que crescem para fora da aorta anéis recrutar células musculares lisas e pericitos para associar com o tubo de células endoteliais, o que significa que eles são anatomicamente semelhantes aos neovasos in vivo. Além disso, o mouse ensaio de anel aórtico tem a vantagem de a vasta gama de ferramentas de transgênicos disponíveis para esta espécie. No entanto, há várias desvantagens para o ensaio de anel aórtico. Primeiro, vasos conseqüência in vivo ocorre a partir de microvasos e não de grandes vasos como a aorta. Inconsistência, segundo o manuseio dos anéis e da quantidade de tecido circundante restante no navio pode influenciar conseqüência navio. Anéis de aorta ou idades diferentes ratos diferentes cepas e também pode interferir com as respostas angiogênico. E por último, conseqüência navio Angiogênicas ocorre em três dimensões, o que o torna não-ideal para fotografar e quantificar. Tomados em conjunto, quando realizada com suficiente controles internos e com múltiplas repetições, este ensaio é relativamente simples, não cara, altamente informativo e significativamente superior às culturas endoteliais em sua complexidade biológica e relevância.