Summary
Bu çalışma, noninvaziv küçük hayvan MRG ve MRS temel prosedürler açıklanmaktadır.
Abstract
Küçük hayvan Manyetik Rezonans (MR) araştırma ve non-invaziv doğası ve sağladığı biyolojik bilgi zenginliği nedeniyle modern biyomedikal araştırmanın önemli bir unsuru olarak ortaya çıkmıştır. MR herhangi bir iyonlaştırıcı radyasyon gerektirmez ve noninvaziv diğer tomografi veya spektroskopik yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek çözünürlük ve daha iyi sinyal-gürültü oranı sağlayabilir. Bu protokol, noninvaziv dinlenme ağırlıklı elde etmek için küçük hayvan MR görüntüleme ve MR spektroskopi (MR / MRS) üzerinde durulacaktır
Protocol
Bölüm 1: Mıknatıs Güvenlik
MRG ve MRS Her ikisi de son derece dikkatli gerektirir güçlü bir manyetik alan kullanır. Örneğin, mevcut iş için kullanılan 4.7 T enstrüman, yeryüzünün manyetik alanı yaklaşık 90.000 kez bir manyetik alana sahiptir. Yüksek manyetik alan MR tarayıcı olmasa bile her zaman açıktır. Gibi yüksek bir manyetik alan ile temas gelen herhangi bir metal nesne, güçlü ve hızlı bir mıknatıs tarafından çekilebilir. Deneysel bir konu veya operatör mermi yolu cazibe merkezi haline uçan metal bir nesnenin içinde yer alıyorsa, son derece tehlikeli. Bu nedenle, MR deneyler yapan personelin, cihazın yakınlığı girmeden önce onların giyim herhangi bir metal nesneleri kaldırmak ve aynı zamanda bu tür nesneleri çevreleyen ortamı korumak için dikkatli olmalıdır. Mıknatıs güvenliği ile ilgili daha detaylı bilgi edebiyat 1 ve aşağıdaki web sayfası görünür : http://www.imrser.org/ . Metalik malzemenin varlığı, yalnızca söz konusu güvenlik sorunu neden ancak görüntüleme / spektroskopik eserler uyararak deney sonuçları ile müdahale edemez. Görüntüleme nesnesi yakınında veya içindeki metalik malzeme mevcut çevresinde manyetik alan değiştirebilir ve böylece elde edilen görüntülerde eserler üretmek veya spektrumları hattı genişliği genişletmek.
Buna göre, mıknatıs dışında cüzdan, anahtar, kalem, vb terk MR prosedürleri için hayvan ele.
Bölüm 2: Yatay Delik Mıknatıs Mouse Vivo MRG
MRI için Hayvan Hazırlama
- Tüm hayvan işlemleri herhangi bir tür hayvan taşıma yürütmek için önce kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış olması gerekir.
- Biz MRI deneyler için hayvanları uyutmak için izofluran buharlaşmış kullanın. Hayvanların Anestezi AVERTIN (2,2,2-tribromoethanol veya TBE), ketamin ve ksilizin bir kokteyl gibi diğer anestezikler ile elde edilebilir. Tablo 1'de her anestezik doz bilgileri bulunur.
- Hattı plastik destekli emici ped (mavi ped veya aynaya) indüksiyon odası. Indüksiyon odasında bir fare (veya çoklu-fare görüntüleme için birden çok fare) yerleştirin.
- Izofluran vaporizatör 0.8 1.5 L / dk debi ölçer ayarlayın. Sonra izofluran buharlaştırıcı yaklaşık 2 3 dakika için% 4 ayarlayın.
- Cerrahi anestezi düzlemde (yani hiçbir ayak tutam yanıt) ulaştıktan sonra, bir burun konisi (veya maskesi) yerleştirilir ve burun üzerinde fare ile bir hayvan sahibinin yerleştirin. Bir kafa süzgeç, kafa görüntüleme için kullanılabilir ve vücut görüntülemesi için kullanılan bir vücut sahibi olabilir.
- Hayvan sahipleri, potansiyel hareketi önlemek için kullanılır: ticari sahiplerinin çeşitli türleri vardır. Ayrıca, özel olarak tasarlanmış tutucu bir deney düzeneği herhangi bir özel gereksinimlerini karşılamak için imal edilebilir. Sadece nonmagnetic malzeme kullanımı için özel tasarlanmış bir tutucu için, emin olun.
- Görüntüleme dönemde 0.4 0.8 ml / dak debi ölçer ayarlamak ve 1.2% 1.5 izofluran buharlaştırıcı azaltmak. Süresi dolan gaz fare burun konisi gelen bir pompa tarafından toplanır ve bir in-house vakum içine kaldırılır.
- Hayvanın gözleri, steril bir göz yağlama merhemi ile nemli tutulmalıdır. Hayvan, 35-37 ° C'de sıcak su dolaşım sistemi içinde deney sırasında tutulacaktır. Diğer tip ısı kaynağı gibi ısıtmalı pedleri ve radyofrekans (RF) bobin içine sıcak hava üflemeli olarak kullanılabilir.
- Bir hayvan izleme sistemi, vücut ısısı, solunum / kalp döngüsü monitör, solunum / kalp yolluk ve görüntü satın almalar ile senkronize etmek için sırada yer alıyor.
- Agaroz yapılmış standart bir örnek ani sinyal değişikliği izlemek için hayvanın yanına yerleştirilir. Bu standart agar örnek multi-slice ve çok zaman nokta görüntüleme için yararlıdır. Elde edilen görüntüleri bir dilim beklenmedik bir sinyal değişikliği tespit edildiğinde, dilim beklenmedik bir sinyal değişikliği ile ortadan kaldırılabilir. Ayrıca, sinyal intensitesi, post-görüntü analizi sırasında standart örnek sinyal değişikliği göre ayarlanabilir.
- Hayvan sahibi, hayvan ve izleme bileşenleri güvenli bir şekilde yerleştirildikten sonra, RF bobini merkezinde hayvan sahibinin konumu.
- RF bobini mıknatıs odaya taşıyın ve RF bobini mıknatıs içine yerleştirilen sıcak su dolaşım sistemi içine yerleştirin. Şekil 2 mıknatıs ön görülen bir MRI tarayıcısı çeşitli bileşenleri delik görüntüler.
MR Deney
- 1 H rezonans frekansı RF bobini Tune ve karakteristik empedansı 50 Ohm MR tarayıcı ayar panelini kullanarak bobin maç. Bu sinyal alımını optimum koşullar elde etmektir. Çoğu insan MRI tarayıcıları dışında ayar / maç ayrı bir işlem gerekmezMRS prosedürleri.
- Tek bir darbe dizisi kullanarak bir layneri işlemi gerçekleştirin. MR sinyali çevre manyetik alan homojenliği dayanmaktadır. Layneri süreci, mümkün olduğu kadar homojen olması ilgi bölgede manyetik alan sağlar. Her MR tarayıcı, hızlı harita ve degrade layneri olarak otomatik hızlı layneri süreçleri de dahil olmak üzere layneri işlemi gerçekleştirmek için kendi yolu vardır.
- Tek boyutlu görüntü profili maksimize RF darbe optimize edin. Doku T 1 5x - darbe uzunluğu sabit ve yaklaşık 3 yeterince uzun bir TR (geri dönüşüm gecikme) tutarken RF pulsu güçler dizilmiş olabilir.
- Görüntüleri aksiyel, koronal ve sagital görüntüler oluşturmak için üç ortogonal yönelimleri boyunca keşif edinin. Hızlı görüntü alma sırası (yani gradyan eko ya da fast spin eko görüntüleme dizisi) izci görüntüler elde etmek için kullanılabilir. Elde edilen görüntüler gerçek görüntüleme görüntüleme uçakların kararlılıkla planlamak için kullanılır.
- Eko sekansı spin değiştirin. Uygun sıra parametreleri seçin: TR (geri dönüşüm gecikme) T 1, proton dansite ve T 2 ağırlıklı görüntülerde tam olarak rahat bir görüntü elde etmek için doku üç ila beş kez olmalıdır. TE (eko zamanı) ilk RF nabız ve yankı sinyali merkezi arasındaki süre. A TE değeri Tablo 2'de özetlendiği gibi görüntü kontrastını bağlı olarak seçilebilir. Şekil 2, sırtında bir xenograft tümör ile çıplak fare için T 1, T 2 ve T 2 * farklı rahatlama etkisi ile elde edilen in vivo görüntülerini gösterir .
- T 2 ölçüm ya multiecho görüntüleme veya birden fazla TE değerleri ile tek yankı görüntüleme kullanılarak yapılabilir .
- MRI / MRS in vivo deney sonra, hayvan kurtarma işlemi boyunca takip edilmelidir. MR görüntüleme sonra, hayvanların RF bobini alınmış ve kafes geri döndüğünde tam bir iyileşme sağlamak için izlenir olacaktır. Isı kaybı anestezi farelerde hızlıdır. Bunları kapsayan gazlı bez ya da havlu ve / veya hayvanlar anestezi iyileşene kadar bir ısı kaynağı sağlayan hayvanların sıcak tutun.
Görüntü İşleme
- İnceleme, MR konsol görüntüleri elde ve post-processing bilgisayara seçilen veri aktarımı.
- Biz genellikle ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ görüntüleri analiz için). Görüntü analizi, filtreleme / görüntü ölçekleme, T 1, T 2 ve difüzyon hesaplamaları, tümör hacmi ölçümleri ve tümörlerin segmentasyon içerir .
Bölüm 3. Dikey Delik Mıknatıs Fare Hindlimb İskelet Kası Vivo MRS
Tersinir İskemi Başlatmaya için Kol İnşaat
- PVC boru yaklaşık 5-7 mm, 12-15 mm id geniş bir parça ile başlayın. Bu parça ve iplik duvar ile küçük bir delik delin.
- Balon (helyum kaliteli balon en iyi çalışmalarınızı) her iki ucunda açık bir parça kesin. PVC parça ile bu parça takın ve çevresinde geri sarın ve bant PVC parçasının dış duvarına birlikte sona erer.
- Balon mühür şal küçültmek kullanın tüp etrafında biter. Sağlam bir dış duvar ve şişirilebilir bir iç duvar ile bir manşet olması gerekir.
- Delik ve PVC parçasının kenarına arasında bol malzeme terk etmeye özen, shrink wrap ve balon dişli delik etrafında bir alan kesin. Konu, PVC deliğe, demir-dışı metal (yani pirinç) 1,5 cm parçası. Bu manşet şişirmek için izin verir. 5 dakikalık epoksi ile alan Seal.
- MRS prob RF bobin yanında yer Fix bu manşet ve harici bir tansiyon aleti bağlayabilirsiniz.
Özel Solunum Monitör
- Biz, dar alan ve mıknatısın delik erişim ile uyumlu olacak şekilde yapılır özel bir solunum monitör kullanabilirsiniz. Birçok ticari modeller de mevcuttur.
- Prob beslenir streç dayanıklı borular sonuna küçük bir balon bağlayın.
- Bir basınç dönüştürücü hortumun diğer ucunu takın.
- Hattı ve balon hava kabarcıkları serbest olduğundan emin olun. Kabarcıkları solunum nedeniyle fare vücut hareketi neden balon sıkıştırma sinyal azaltacaktır.
MRS Probe Fare Konumlandırma
- % 5 Avertin (0.010 ml / g vücut ağırlığı) ile fare anestezisi.
- Anestezi, cerrahi düzlemine ulaştıktan sonra, fare desteği sırtını fare koyarak MRS prob fare pozisyonu. Fare ventral tarafında sıvı dolu balon yerleştirin ve fare destek kayışları ile güvenli.
- Pozisyon fare ve vücut destek MRS prob.
- Iskemik manşet ve MRS bobin aracılığıyla bir hindlimb çekin. Bacak mu bobin merkezli olmalımümkün olduğunca ch. Bu düzenleme, fare vücudu dikey bir delik mıknatıs (Şekil 3) yatay konumda olması sağlar.
- Sağlam bir destek ayak taping yer bacak sabitleyin.
- Bobini ile örneklenen bölgenin dışında hindlimb subkutan termokupl yerleştirin.
- Gözleri gözlerin kurumasını önlemek için göz yağlama merhem ile ıslatın. Fare gözlerini Kapak ve prob duvara sürtünme veya tahriş olmasını önlemek için yüz.
- Diğer izleme probları Deney özel ihtiyaçlarına göre eklenebilir.
MRS Deney ayarlama
- MRS prob ısıtma elemanı hava akımı bağlayın.
- VNMR yazılım 35-37 bacak sıcaklığı korumak için değişken sıcaklık kontrol ünitesi ° C'ye ayarlayın
- Bobin, frekans ve 1 H ve 31 P rezonanslar MRS yazılım ayar panelini kullanarak maç empedans ayarlayın .
- 1 H spektroskopi kullanarak ilgi bölgede B1 manyetik alan homojenliği optimize etmek için devreleri layneri ayarlayın.
- Bir serbest indüksiyon çürüme (FID) (90 ° süre) maksimum sinyal verim RF darbe genişliğini belirlemek için 31 P frekans geçin.
- Tamamen rahat koşullarda ATP inorganik fosfat oranları (P) ve phosphocreatine (PCr) belirlemek için yüksek sinyal gürültü tam rahat spektrumları (FRS) toplayın. FID satın almalar arasındaki zaman (TR) ile 90 ° Bu spektrumlar kullanılarak toplanan yaklaşık 5x PCr T 1 (20 sn. Az 7 T). Bu MR spektrumları PCr ve P i düzeylerinin ölçümü için kullanılır.
İskemik Deney
- Basit bir iskemik pertürbasyon sırasında phosphocreatine değişiklikleri ölçerek belirlenmesi için istirahat ve maksimal mitokondriyal ATP üretimi sağlar ve hemen iskemi sonrası.
- 45 kullanarak birden fazla spektrumları toplamak için Set-up dizi ° darbe genişliği (yani 0,5 x 90 ° kez) ve 0.5x bir TR T 1 (~ 1.5 sn.) Biz genellikle yaklaşık 6 saniyelik bir zaman çözünürlüğü için her spektrumları (VNMR yazılımı olarak ortalama sayısı (na) = 4) için 4 FIDS topluyoruz. Bu sefer çözünürlük, dinlenme ve maksimal mitokondriyal ATP üretimi doğru belirlemek için yeterli.
- Yaklaşık 5 dakika dinlenme spektrumları toplayın.
- 10-12 dakika boyunca 270-300 mmHg kaf şişirme iskemi neden.
- Manşet bırakın ve 5 dakika boyunca kurtarma spektrumları toplamak.
- Prob mıknatıs ve fare prob çıkarın. Fare uygun koşullar altında anestezi kurtarmak için izin verin. Deneyler sonraki gün tekrar edilebilir. Son spektroskopi deneyi fare bacak kasları HPLC ile ATP konsantrasyonlarının analizi için sıvı N 2 kaldırıldı ve hemen donma-kenetlenir.
Veri Analizi
- Veri NMR spektrumları için çeşitli spektral analiz programları kullanarak çevrimdışı analiz edilir. Laboratuvarımız genellikle pik alanları ölçülmesi için standart 2 ve jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) için uygun kullanır.
- Iskemi sırasında ilk PCr arıza oranları, 3-5 çeşitli gazetelerde anlatıldığı gibi, normoksik koşullar altında mitokondriyal ATP üretiminin bir ölçüsüdür. PCr kurtarma oranları, daha önce 4,6 açıklanan yaklaşım dayalı mitokondriyal ATP üretimi için maksimum kapasitesini belirlemek için kullanılabilir .
Şekil 1 mıknatıs ön bakıldığında in vivo MR kurulum taşıyordu. Kurulum RF bobini, hayvan ısınma sistemi (veya sıcak su dolaşım sistemi) ve degrade ekleme oluşmaktadır. Bütün bu bileşenler, yatay bir cazibe merkezi haline sokulur. Mıknatıs odası dışında bir su deposu Sıcak su ısıtılır ve hayvan ısınma sistemi içine bir Tygon tüp (yeşil bant) ile tanıtıldı. Silindir dolaşan sonra, su ısıtılacak su deposu ısınma sisteminden geri çekilir. Izofluran bir tüp ve vakum tüpü MRI Deneyler sırasında fareler uyutmak için kullanılır.
Şekil 2 farklı rahatlama etkileri ile sırtını (ok) xenograft tümör (D282 tümör) ile çıplak fare için in vivo görüntüler: A. T 1 resim (TR / TE = 500/14.2ms) ağırlığındaydı. B. T 2 görüntü (TR / TE = 2s/40ms) ağırlığındaydı. Her iki T 1 ve T 2 ağırlıklı görüntülerde spin-eko sekans tarafından satın alındı. C. T 2 harita dif tarafından elde edilen görüntü 4 set ile işlenmiş20 ile 80 ms arasında değişen ferent TE değerleri. D. T 2 * tartılır (TR / TE = 180/7.39ms, flip açısı = 20 derece) gradiyent eko dizisi tarafından satın aldı. 35 x 35 mm 2 'görünümü alan tüm MR görüntüleri.
Şekil 3, bacak yatay gövde tutucu konumlandırılmış fare İllüstrasyon RF bobini sabitlenir .
Şekil 4 in vivo 31 P spektrumları bir iskemi reperfüzyon döngüsü boyunca. Veriler, 20 Hz üstel filtresi ile genişlemiş bir 7 T dikey delik mıknatıs ve hat üzerinde toplanmıştır. TR = 1, na = 4, her 20 spektrumları çizilir.
Tablo 1. Fare MRI / MRS anestezik dozu.
| Hayvan Tür | Anestetik Ajan | Doz (Mg / enjektabllar kg) | Rota |
| Fare | İsofluranın gaz | 2-3 dakika (gidiş) için% 4.0, sürekli daha sonra 1,2 ile% 1.5 (bakım) | Burun konisi yoluyla inhale |
| Fare | Avertin | % 5, 10ml/kg vücut ağırlığı | intraperitoneal (IP) |
| Fare | Ketamin / Xylazine | 100 mg / kg ve 10 mg / kg | IP |
Tablo 2. Rahatlama ağırlıkları ile Görüntü
| Resim Ağırlıklandırma | TR (geri dönüşüm gecikme) | TE (eko zamanı) |
| T1 | Kısa (T1 den daha kısa) | Kısa (T2 den daha kısa) |
| T2 | Uzun (3 ~ 5 kez T1) | Uzun (T2 yaklaşık) |
| PD (proton dansite) | Uzun (3 ~ 5 kez T1) | Kısa (T2 den kısa) |
T1: dönmeye kafes gevşeme (veya uzunlamasına rahatlama)
T2: Spin Spin gevşeme (veya enine rahatlama)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Melodi / maç ve layneri edinme öncesi adımlar, yüksek uzaysal çözünürlük ve yüksek sinyal-gürültü oranı (SNR) elde etmek için kritik öneme sahiptir. Insani hayvan taşıma uymak ve herhangi bir potansiyel artefakt ölçümleri engellemek için sinyal satın almalar sırasında hayvanlar için istikrarlı bir fizyolojik durumunu korumak için bir hayvan izleme sistemi ile hayvan koşullarını izlemek için de önemlidir. Difüzyon, perfüzyon ve akış görüntüleme ve in vivo olarak yerelleştirilmiş spektroskopisi de dahil olmak üzere ek bilgi elde etmek için protokol açıklanmıştır prosedürleri değiştirilebilir. Bir prosedür, ek bir kurulum gerektirir sürece tüm hayvan hazırlıkları benzer olmalıdır. Bu çalışmada açıklanan MRG ve MRS protokolleri mitokondriyal ATP üretimi 5,8 için tümörleri 7 ve MRS hedef nanoprobes gelişimi için uzunlamasına MRG çalışmaları da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılmaktadır. MRG ve MRS noninvaziv hayvan anatomik, dinlenme değişikliği görselleştirmek veya nondestructively metabolizmasını izlemek için yararlı teknikler vardır. Her iki teknikte de, zaman içinde yukarıda belirtilen değişiklikleri incelemek için uzunlamasına izleme prosedürleri olarak kullanılabilir. MRS için hayvan dikey delik bir mıknatıs yatay konumda muhafaza edilmelidir olanak sağlayan özel bir RF prob inşa etti. Böylece, bu deneyler en kimya bölümlerinde bulunur gibi, herhangi bir dikey ve geniş çaplı bir mıknatıs olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışmada, DL ve NIA AG028455 ve DJM NIA AG022385 NIH / NIBIB R21EB008166 tarafından kısmen desteklenmiştir. Dr James Olson, Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi D282 tümör fareler sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inova 200 MR scanner/4.7 T | Varian Inc., Agilent | Used for mouse MRI | |
| Inova 300 NMR spectrometer/7 T | Varian Inc., Agilent | Used for MRS of mouse skeletal muscle |
References
- Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art. Radiol Med. 112, 491-491 (2007).
- Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes. Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).
- Amara, C. E. Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics. Methods. 46, 312-312 (2008).
- Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle. J Physiol. 465, 203-203 (1993).
- Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).
- Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity. Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).
- Sun, C. In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes. Small. 4, 495-495 (2008).
- Marcinek, D. J. Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle. J Physiol. 569, 467-467 (2005).
