ザリガニ開閉筋肉のNMJにおいて歴史的なビューと生理学のデモンストレーション

Summary

ザリガニの脚のオープナーの筋肉は、筋肉の表現型、シナプス生理学と可塑性におけるその歴史的重要性と実験的な汎用性のために提示されます。

Abstract

ここでは、甲殻類のオープナー神経筋（NMJ）の準備で作成したキーの重要な発見のいくつかを提示し、このモデルの準備から学ぶことがまだたくさんあることを示しています。このNMJはまだプレとポストシナプス機能と可塑性についての質問に対処するための豊富な遊び場を提供している理由でも、今日の歴史を理解することで1つは理解することができる。細胞内の端末へのアクセスだけでなく、細胞外電気生理学とイメージングの可能性と使いやすさは大きな利点です。高と低出力端末の小胞動態と融合の変調の背後にあるメカニズムは、調査のために懇願されています。製剤は、短期的なファシリテーションの間に例のカルシウム動態については、シナプス機能の理論的なモデルで重要な変数を調べるために、計算の評価と操作のためにテスト可能なモデルシステムを提供しています。アクティブゾーンと量子的放出の統計的性質のシナプスの複雑さはまた、両方の実験とコンピューター計算で将来の調査のためのオープンエリアです。

Protocol

はじめ

甲殻類の神経筋接合部は、長年にわたって生理学へと、特にシナプス生理学に重要な貢献を提供している。解剖と生存率の容易さは、おそらく初期の解剖や実験の準備として甲殻類を使用するために後で生理学を推進重要な要因です。特にザリガニは、ほとんどの淡水の河川や湖沼だけでなく、彼らが冷たい、海水の環境を必要とする甲殻類と比較して実験室で維持しやすいから簡単に得ることができる。

バック1800年代後半に動物学者は、心臓特定の甲殻類の種（すなわち、crayfishes）にかかったと題する本を書いたザリガニ （ THハクスリー 、1879）を。このテキストは、年間のこれらの生物のガイドブックを務め、現在はまだ選択的生活史、解剖学や生理学を扱うcrayfishesに関する包括的な本として賞賛されています。ハクスリーは、すべての面で動物学の深さに飛び込むことをモデル動物としてのザリガニを見る、従って、彼の本の包括的な性質。生理学は、カエルの心臓の準備（リンガー、1882a、b）を維持するために必要なイオンのリンゲルを理解して後半に1880年代に開花したようにタイミングが有利であった。これはおそらく生理実験では同様にザリガニなどの他の種に迅速に進行している理由の一つです。また、甲殻類の準備を維持するために生理食塩水は、1936年にヴァンHarreveldによって記述されていた。

驚くほどザリガニの脚のオープナーの筋肉の神経支配は、歴史の中でこの時間（ビーダーマン、1887）の周りに特徴付けされていた。しかし、さらに驚くべきことは、生理学的研究はすでにフランスではシャルルリシェによるザリガニの筋肉で進行中だったことです。実際には、ザリガニの実験は、おそらく神経筋（NMJ）（;もリシェ、1881を参照してくださいリシェ、1879）での円滑化を実証する最初かもしれない。今後数十年にわたりザリガニのNMJsは張力発生と解剖学（ヴァンHarreveldとWiersma、1936年）に関しての解剖学的および生理学的に説明されていた。

鋭い電極（Lingとジェラルド、1949）と細胞内記録の出現は、、質問の異なるセットに対応するフィールドを活性化。甲殻類の筋肉が（;カッツ、1949;カッツ＆カフラー1946 Wiersma、1949）段階的な収縮を生じることが知られていたが、それはファットとカッツは、カニの筋線維の短期促進の膜電位を記録した1953年までではなかった。

Dudelとカフラーはこの筋肉の円滑化を実証し（; Dudel、1963、1965a 1961a、b）の¹回目^の時のためにシナプス前抑制の現象を示したときにザリガニの手足のオープナーの筋肉は再び1961年に強調された。彼らはまた、このNMJ（1961b）におけるシナプス伝達の量子の性質を報告した。過去50年間で準備し、シナプスの生理学を監視するために使用されるさまざまな技術に与えられる注目のかなりがあった。この準備を用いた調査のビュー上に簡単なため、我々は全体の筋肉が興奮もう1つは選択的に刺激することが抑制軸索によって支配されていることに注意して開始します。アトウッド（1964）は興奮性シナプス後電位は、筋肉の緊張を促進し、生産刺激の電車で実証。 Irava​​ni（1965）筋の地域に応じてシナプス応答の地域差について報告した。その後すぐにDudel（1965a、b）は、オープナーで神経終末に沿って電位を記録し、増加させることにより神経修飾物質のセロトニン増強シナプス伝達は量子コンテンツを意味することを示した。

この時点では、これは甲殻類の筋肉がグルタミン酸に反応し、様々なアミノ酸と同様にGABA（;ロビンス、1959; Kerkut ら 、1965。ヴァンHarreveldとメンデルソン、1959）ことが立証されました。 GABAの抑制反応は、フローリー（Bazemore ら 、1956、1957）、その他（Boistelとファット、1958）によって同定した。後でGABAを単離し、Kravtiz（クラヴィッツとポッター、1965クラヴィッツ、1962;クラヴィッツら 、1963a、B。）により確認されたロブスターのオープナの準備の軸索から。

ザリガニの筋肉は簡単にアクセスできる準備だけを提供したが、1つは、単一の識別可能な運動ニューロンの生理学的および構造的なレベルで様々なシナプス応答をもたらすことができますどのように勉強することができます。特に、オープナーの筋肉は、単一の興奮性運動ニューロンによって神経支配されていますが、異なる場所での興奮性シナプス後電位（EPSPのは）背側表面的な繊維の50倍（ビットナー家オーナー、1968a、b）の上の変化と腹側表面的に同じくらい8と倍にできます。繊維（Irava​​ni、1965）。

"独創性と>は、ザリガニのオープナーNMJが短期的なファシリテーションに加えて、長期促進（LTF）（シャーマンとアトウッド、1971）、、対処する必要がこれらの現象のメカニズムの基礎を示すこと。副作用として発見メモ、長期増強（LTP）はザリガニNMJでの現象の元の発見に引用することなく（ブリスとL MO、1973）二年後に脊椎動物の脳で発見された。この時期から、属性に焦点を当てた多くの研究者にアトウッドら 、1994;。ザッカー、1973、1974a、B、ビットナー家オーナーとシュー、1976;。パーナスら 、STFとLTFは、細胞のメカニズムを（アトウッド、1973、1976、1982勉強するザリガニのオープナーのNMJを使用しての1982a、b、c、dは、Dudel ら 、1983;。。Vyshedskiyや林、1997a、b、c）にもフォーカスポイントは、オープナーの筋肉に様々な筋肉の線維を支配する単一の運動ニューロンが生じさせることができる方法を理解してきましたこのような多様なシナプス応答へ（リンダー、1974; G · nzel ら 、1993;。Govind ら 、1994;。Iravani、1965;アトウッド、1967;ビットナー家オーナー、1968a、B、シャーマンとアトウッド、1972;ザッカー、1974a;パーナスら 、1982a;。Zuckerとハイドン、1988; Dudel、1989a、b、c、dは）。

差動シナプス応答のためのアカウントへのシナプスの構造は微細構造解析（Jahromiとアトウッド、1974）を経由して調査することができる。活動に起因するイオン性の違いの対策は、Ca2 +とNa +の指標だけでなく、Ca2 +のバッファ（。モルキーとザッカー1993;ウィンスローら 、2002）の軸索の注射を調査することができ、これらのフラックスは、端子（ウィンズローの中でモデル化することができます。 ら 、1994;。Cooper ら 、1996b）。。活動依存の適応（アトウッドら 、1991。）と神経修飾物質の受容体サブタイプ（Dropic ら 、2005の薬理学的同定;。ラフナーら 、1999;。スパークスとクーパー、2004;スパークスら 、2004;。テイバーとクーパー、2002;）シナプス小胞プールと動態に影響を与える（ログスドンら 、2005;。サウサードら 、2000; らスパークス 、2003）にも対処すべき新たな疑問への道をリードしている検討されている。。 STF対オープナーNMJでのシナプス伝達における膜の脱分極中のカルシウムの役割の概念は、意見のいくつかの相違点（; Hochner ら 、1989モルキーとZucker、1991）につながる。

比較的最近、単一の運動ニューロンからのシナプス強度及び円滑化の地域的分化は、対処されており、シナプスの構造と生理学（アトウッドらの地元のシナプスの変化、1994年からの相違に起因すると表示され、。アトウッドとクーパー、1995、1996a 、B、Cooper ら 、1995b、1996a、b）の。。電子顕微鏡写真の研究から超微細構造解析はvaricositiesがシナプス接触の大部分が含まれていることが示されている（フローリーとCahillさん、1982; Cooper ら 、1995b）。シナプス伝達の強さは、シナプスの構造（。。; Govind ら 、1994年Cooper ら 、1996a）の複雑さに起因すると思われる、単一の端末の長さに沿って減少する。シナプスの構造の違いは、さまざまな周波数（Cooper ら 、1995b、1996b）における刺激時のCa2 +の流入の違いを説明する部分で可能性があります。

オープナーの筋線維間の筋肉の表現型と生化学の地域差（。。G · nzel、 ら 、1993; Mykles ら 、2002）があるので地域に分割され、分化段階の筋肉の表現型を説明することができますそのの影響と運動ニューロン（Mykles ら 、2002）の地域的な違いを維持します。合理的な説得力のある証拠とロブスターに、（Nudellとグリンネル、1983）カエル骨格筋で検討されている（カッツら 、1993）逆行の影響の考え方、そしてザリガニの（Lnenickaとメロン、1983）。端末は1cmから互いに距離で10cmまで測定できるので、他の端末に影響を与えることなく、単一のニューロンの端末のローカル規制は甲殻類の運動神経細胞に空間的にかなり可能です。脊椎動物とは異なり、モータユニットは、無脊椎動物で、複数その筋肉を（アトウッド、1973年のレビューを参照）を含むことができる。全体オープナーの筋肉をinnervates刺激神経運動ニューロンは、より下肢近位セグメントのストレッチャー筋肉をinnervates。オープナー筋の筋線維の間にファシリテーションの測定値は、Ca2 +イオン（Cooper ら 、2005B）および/ ​​またはおそらく共同でリリース（パーナスら 、1982a、b）で安静時のレベルに関連している可能性がある違いがあることを示した

オープナーの筋肉の端子に沿って、高と低出力シナプス間の構造的複雑さの違いはACTIの募集に関して量子署名を調べたSTFの間にシナプス間でのゾーンのVEの使い方が、これは（ランカスターら 、2007; Viele ら 、2003、2006。）を把握することは困難であることが証明されている。 。スパークスとクーパー、2004;高と低出力シナプス間の小胞の可能なプールはneromodulatorsが低く、高出力端子（ログスドンら 、2005差動効果を有することが知られているように速度に差調節されることが証明されます。 Cooper ら 、2003）。

それは50年、​​100年前にしてきたようにザリガニのオープナーの筋肉の準備の将来の使用は豊富である。準備は、他の多くのシナプスの製剤に比べてまだ非常に丈夫です。量子応答は、明確に定義された各種端末での小胞のダイナミクスのためにイメージングだけでなく、シナプスの連絡先に直接記録された電気生理学的にすることができます。準備は、興奮性と抑制性入力のために単一の識別可能な神経細胞を有することでその魅力を失ってはいません。ザリガニは、遺伝子操作のための実用的ていないにもかかわらず、研究は、 ショウジョウバエ用としてシナプス蛋白質の役割に対処することが可能です。蛋白質の注入の研究で（彼がら 、1999）で調べることができるショウジョウバエ NMJsへのシナプス機能（アトウッドとクーパー、1995、1996a、b）における多くの類似点があります。多くを説明するために、運動神経終末内のシナプス小胞プールの規制はSTF時のカルシウム調節（デサイ- Shahさんとクーパー、2009年。デサイ-シャーら 、2008）を理解することも今後の検討だけでなく、機械論的研究のための豊富なエリアです。シナプス伝達のファンダメンタルズの残りの謎の。

の方法

解剖

ボディの長さが6〜10センチメートル（アチャファラ生物サプライ（株）、レースランド、LA）を測定ザリガニ、 ザリガニは 、強制的に坐骨セグメントでつまんで第一または第二歩行の脚をautomizeするように誘導されています。

一つ外側（側面）を確認できるようになるまで足を好転させるには、解剖のプレート上に上を向いている。これは通常、アーチ形が上です。ティッシュの紙に足を置くと、これらのカットをしながら準備を容易に変えることができるようにすることができます。

手術用メスの刃ブレーカとホルダーとの鋭いカミソリの刃は、ちょうど長節セグメントは、この図に示すように、パターンの貫通切削までエッチングキューティクルするために使用されます。腕節ジョイント - ケアは長節によって腹側のカットに背上にはるかに遠位に切らないように使用する必要があります。今の場所でキューティクルを残す。

propoditeでキューティクルエッチカミソリの手術用メスの刃を持つだけ近カットに参加する他の側に繰り返して片側にpropoditeセグメントについては、上記の図に示すようなパターンで通り抜けるとなるまで。ケアは、オープナーの筋肉にカットしないように使用する必要があります。これは、キューティクルを切断するときに近い筋に傾いた刃を保つことによって行うことができます。また、腹側のカットに背のために、腹側の周囲に接続して、ジョイントの接続が狭いと、簡単に壊れているとあまりに近位切断しないように注意してください。今の場所でキューティクルを残す。

製剤は、生理食塩水に入れてください。この解剖皿には、底部にSylgard（ダウコーニング）コーティング（厚さ1cm）を持つ必要があります。Sylgardが虫ピンがまだ準備を保持するためにそれにスタックできるように使用されます。この時点で、長節で行われたウィンドウから、カットの中で、背尾側の角にピンを刺す。
細かいピンセットで（＃5）先端からわずかにキューティクルを持ち上げ、かみそりで、近位的に遠位で切断、離れてキューティクルから屈筋の筋線維を切る。キューティクルのオフのウィンドウを持ち上げます。

今長節で内突起（腱）をカット - 腕節ジョイント（下図）。カットを行う前に足の空洞から腱を引っ張るだけ腱と腱の内側にあるか主脚の神経を切断するために非常に注意してください。それはピンセットで切断された腱をつまんで、尾の方向に持ち上げて、屈筋をやってのける。今メインの脚の神経と伸筋が公開されています。

propoditeセグメントに進み、今propodite dactylopでカットジョイントをodite。ここに近い腱は多分キューティクルの添付ファイルからカット。尾部領域で接続された筋肉が見えやすいように、尾側にダウンとバックpropoditeの腹側（近い筋肉側）のセグメントを引き出します。かみそりでこれらの筋肉を切る。オープナーの筋肉に運動神経の枝をカットジョイントとリスクに閉じすぎて筋肉を切断しないように注意してください。オープナーの筋肉は今生理食塩水にさらされています。

オープナーの筋肉への興奮性と抑制性運動ニューロンを含む神経束を分離するために長節領域に戻る。長節セグメントの最も尾部領域では下肢の神経束は、通常、分離された神経線維束が含まれています。つのバンドルを見ることができるこの短い領域では、背側バンドルが細かいハサミでtransectedすることができる場所です。切り口は、第5ピンセットでピックアップされると長節セグメントの約半分の長さに達するまでゆっくりと遠位方向に引っ張らできます。この長い神経の枝は、興奮性オープナーの神経が含まれており、神経の大規模なバンドルは、オープナーの筋肉の抑制運動ニューロンが含まれています。

長節セグメントの準備は今虫ピンは長節の背側面を介して配置できるように対角的にカットされます。これは、最大ので、オブザーバー（下図参照）に直面するオープナーの筋肉の腹側面に配置されます。

ブロックオープナーの筋肉のビューは、現在propodite空洞のキューティクルと外に対して繊維を押すことで削除できることに近い筋の残存繊維。時には、結合組織は、慎重に＃5ピンセットを使用して削除することができるオープナーをカバーしています。オープナーの筋肉に沿って実行し、指節に入るメインの脚の神経は、指節関節またはうまくピンセットでプルアップの開始時にどちらかカットすることができます。この主脚神経、時には明らかな関連する血管は、現在、オープナーの筋肉の長さのために近位方向に優しく引っ張られるし、離れてカットすることができます。

今オープナーの筋肉は、細胞内電極またはフォーカルmacropatch電極の方法で取得する任意の組織なしに公開されます。

オープナーの筋肉への興奮性神経を刺激するために準備は今プラスチックの吸引電極で設計された録音室に移動されます。チャンバー内に組み込まれた刺激電極を持つことは、刺激電極を配置するマイクロマニピュレータを使用する必要がなくなります。記録の皿に準備を突き止めると吸引電極における興奮性神経を含む神経の枝を置く。

（はから取ら：Mykles、DL、Medler、SA、Koenders、A.、そしてクーパー、RL（2002）筋原繊維タンパク質アイソフォームの発現は、ザリガニやロブスターの爪と足オープナーの筋肉の遅い線維にシナプス伝達効率と相関しているのジャーナル。実験生物学205（4）：513〜522）。

生理食塩水

（：、5.3 KClを、13.5 CaCl2.2H2O、2.45 MgCl2.6H2O、pH7.4に調整した5 HEPES 205塩化ナトリウムmMで）解剖の準備はザリガニ生理食塩水、修正ヴァンHarreveldの溶液中で保持されます。

細胞内のEPSPの記録

誘発反応を引き出すために、興奮性軸索が選択的にグラスの刺激によって刺激される。オープナーの筋肉の領域は、3 MのKClを充填したシャープな細胞内電極（20〜30オームの抵抗）でimpaledている。標準的なヘッドステージと細胞内記録用アンプを使用することができ、しかし、我々は（Molecular Devices社、サニーベール、カリフォルニア州、米国）モデルは2B Axonclampアンプと1 X LUヘッドステージを使用。短期の円滑化（STF）または、目的の反応の様々な他のタイプは、刺激の条件を変化させることによって得ることができます。 STFは、興奮性神経に、それぞれ、10または20秒間隔で10または20パルスのパルス列を与えることによって得られる。電車内で刺激の周波数は（40、60および80 Hz）を変化させることができる。 intrオプション無細胞EPSPの記録は、日常的にこれらの標準的な手順によって実行されます（クライダー＆クーパー、1999、2000;。Cooper ら 1995b; Dudel、1983;スパークスとクーパー、2004;デサイ- Shahさんとクーパー、2009）。

、遠位中央と近位：オープナーの筋肉は3つの一般的な地域に分かれています。全体オープン筋肉が単一の運動ニューロンによって支配されている場合でも、NMJsは構造的に異なっており、これらの3つの一般的な地域（Cooper ら 1995a、b）のシナプス伝達効率の地域固有の違いがあります。筋線維の表現型のタイプも（Mykles ら、2002）これらの地域で異なることが示されている。それらは容易に準備の間で一貫性のために区分されますので、これらの理由から、最も遠位の繊維が、使用されています。

直接神経終末の識別可能な地域にわたって焦点量子EPSPの記録

シナプスvaricositiesは生体染色色素4 -ジ- 2 - ASP（Magrassi ら 、1987）、シナプス伝達に影響しない、雇用濃度と時間に（5μM、5分の治療、Cooper らによる可視化。、1995b）。 （。。Cooper ら 、1995c;セント¨ hmer ら 、1983）蛍光顕微鏡、マクロパッチの記録電極の内腔を持つ単一の孤立した静脈瘤の上に直接配置することができます。上記のように神経終末を想起させる、興奮性運動神経が刺激される。自発ならびに誘発量子反応を穏やかに内腔を下げ、それぞれの静脈瘤の上に上げることによって、可視化varicositiesの文字列に沿って記録することができます。

Wojtowicz ら 、シナプス電位は基本的にDudel、1981に記載されているようにマクロパッチ電極を介して記録されます。 （1991）とMallart（1993）。 Kimaxガラス（外径：1.5 mm）を引っ張り、10〜20μmに至るまでの内径とパッチのヒントを生成するためにファイアーポリッシュされた。電極の内腔は、入浴媒体で満たされている。アンプは、上記の細胞内記録用に使用されるものと同じです。電極とシール抵抗は、電極を介してテスト電流パルスを渡すことによって決定することができます。シール抵抗は0.3から1.0 M0hmの範囲であり、電極の抵抗は0.5〜1.0 M.0であった。シール抵抗は録音を通してモニターすることができます。

量子イベントの直接計数は、低刺激の周波数で可能です。それぞれの誘発反応のために、量子イベントの数を決定することができます。応答のシリーズでは、量子のイベントの合計数は、その後、これらの直接のカウントに基づいて、平均量子コンテンツを推定するためにカウントされます。計算量子コンテンツを意味する1つの手法は、応答の合計数（デルカスティーとカッツ、1954）によって量子と除算の合計数を取っている。同様EPSPSのピーク振幅または面積（Cooper ら 、1995b）に基づいて、ひとつのプログラムが使用できる他のアプローチがあります。