Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

चिकी पूर्व ओवो संस्कृति और पूर्व ओवो सीएएम परख: यह कैसे सच में काम करता

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

लड़की chorioallantoic झिल्ली (सीएएम) एक अद्वितीय है, स्वाभाविक रूप से immunodeficient सहायक संस्कृति angiogenesis और tumorigenesis अध्ययन वातावरण है. यह वीडियो लेख चूजा में विभिन्न चरणों को दर्शाता है

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

सभी उपकरण और अभिकर्मकों बाँझ खरीदा जा या गर्मी या भाप निष्फल या 70% ETOH साथ निष्फल होने की जरूरत है.

लेखकों राज्य है कि जानवरों पर प्रयोगों में प्रदर्शन किया गया यूरोपीय परिषद निर्देशक 86/609/EEC () समुदाय के अनुसार देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रिया और संस्थागत पशु द्वारा निर्धारित नियमों के लिए पशुओं के उपयोग के बारे में NIH के दिशानिर्देश का पालन, देखभाल और विश्वविद्यालय ड्यूसबर्ग-Essen (जर्मनी) में समिति (IACUC) का उपयोग करें.

भाग 1: अंडे की ऊष्मायन

  1. निषेचित अंडे 13 ° C पर संग्रहीत किया जा सकता है एक सप्ताह के लिए.
  2. अंडे 72 घंटे के लिए incubated रहे हैं, एक चलती ट्रे के साथ, एक मशीन में क्षैतिज झूठ बोल रही है अंडे घूर्णन 12 बार एक दिन लगातार. आर्द्रता 60 में रखा जाता है - 62%, 37.5 पर ऊष्मायन तापमान डिग्री सेल्सियस
    नोट: इससे पहले कि ऊष्मायन, गंदगी, पंख और मलमूत्र शुरू अंडे के गोले से ध्यान हटा रहे हैं, आम, ग्रे वक्र हाथ कागज तौलिये, जो एक नरम सतह की संरचना के बजाय किसी न किसी के साथ शुष्क पोंछते द्वारा यंत्रवत्. इथेनॉल या निस्संक्रामक के साथ अंडे पोंछते, तथापि, काफी भ्रूण के अस्तित्व के बिना इस्तेमाल किया तरल, दर कम है.

भाग 2: पूर्व ओवो संस्कृति

  1. 72 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, अंडे इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं.
    नोट: अंडे 72 घंटे के लिए incubated रहे हैं क्योंकि - अज्ञात कारणों के लिए, लेकिन Auerbach एट al.1 पहले विकास के चरणों के साथ समझौते में काफी कम जीवित रहने की दरों था - हमारे प्रयोगों के लिए अनुसार. चरणों में 72 घंटे बाद की तुलना में जो सीएएम द्वारा अभी तक कवर नहीं है जर्दी बोरी पतली हो जाती है और अंडे पालन के क्षेत्र में छोटे haemorrhages और (ii) जर्दी बोरी का टूटना करने के लिए अग्रणी (i) के खोल का पालन जाता है झिल्ली. इसलिए प्रस्तुत विधि 72 घंटे से अधिक उम्र के भ्रूण को लागू नहीं है.
  2. अंडे के ऊपर की ओर, जहां भ्रूण रहता पेंसिल द्वारा चिह्नित है के बाद भ्रूण को एक निश्चित सीमा के लिए रोटेशन को तैयार नहीं है.
  3. अंडे क्षैतिज शीर्ष पर पेंसिल के निशान के साथ आयोजित किया जाता है और एक 80 मिमी त्रिकोणीय चुंबकीय हलचल अंडे की लंबी अक्ष के लिए उन्मुख सीधा बिछाने पट्टी के किनारे पर फटा.
    नोट: एक बेहतर महसूस के लिए, कोई दस्ताने, प्रयोग किया जाना चाहिए लेकिन हाथों 70% EtOH के साथ कीटाणुरहित किया जाना चाहिए. यह महत्वपूर्ण है कि अंडे के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंडे झिल्ली खोल खोल रहे हैं. अंडे का सफेद लीक एक सुरक्षित संकेत है कि अंडे झिल्ली छेदा किया गया है.
  4. अंडे पेट्री डिश के तल के पास रखा जाता है अंडे का सफेद के आगे रिसाव से बचने के.
    नोट: प्रारंभिक खोलने की प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि अभी भी इस परिणाम के रूप में पेट्री डिश के तल पर सफेद अंडे अंडे के अंदर एक निर्वात है जो अंदर शीर्ष पर भ्रूण के साथ जर्दी धारण में अंडे के अंदर आराम करने के लिए कनेक्ट अंडे. वैक्यूम उंगली का दबाव, जो अंडे में हवा का प्रवेश नियंत्रण द्वारा या अंडे जो जुड़ा अंडे का सफेद वैक्यूम यानी स्तंभ बढ़ उठाने द्वारा विनियमित किया जा सकता है.
  5. धीरे यिन और अंगूठे और मध्यम उंगलियों के द्वारा अंडे की दरार और भूमध्य रेखा के माध्यम से चल रहा है दबाव लागू करके यह निर्वात को विनियमित करने के लिए संभव है. अंडे की सामग्री तो पेट्री undamaged पकवान करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है, अगर जर्दी के साथ अंडा धीरे उठाया है और खोल के दोनों आधा सावधानी से अलग कर रहे हैं. भ्रूण और जर्दी वाहिकाओं एक undamaged की जर्दी के शीर्ष पर झूठ चाहिए.
    नोट: यदि पेंसिल निशान शीर्ष पर नहीं रखा जाता है, जब भ्रूण खोल खुर चोट हो सकता है. यदि ध्यान से पर्याप्त अंडे नहीं टूट कर रहे हैं या भ्रूण 72 घंटे से अधिक उम्र के हैं (ऊपर देखें), जर्दी बोरी खोल और अक्सर ruptures के लिए चिपक जाती है. एक ही होता है जब इनक्यूबेटर नमी 60% से कम या अंडे घुमाया ऊष्मायन के दौरान नहीं कर रहे हैं.
  6. पूर्व ओवो संस्कृतियों को एक मशीन को लौट रहे हैं और 37.5 38.2 ° डिग्री सेल्सियस और 60% आर्द्रता पर रखा . अगर इनक्यूबेटर भली भांति बंद करके बंद नहीं (वेंटिलेशन ग्रिड आंशिक रूप से खुला!) और ढक्कन और पकवान के बीच spacers के साथ विशेष पेट्री डिश उपयोग किया जाता है सीओ 2 या हे 2 आपूर्ति के लिए आवश्यक नहीं है.
    नोट: भ्रूण के स्थानांतरण ऊष्मायन के पहले दिन के दौरान एक न्यूनतम करने के लिए रखा जाना चाहिए . उच्च मृत्यु दर में बहुत ज्यादा आंदोलन का परिणाम है. ऊष्मायन दिन 9 के बाद से, भ्रूण कम आंदोलन के प्रति संवेदनशील हैं.
    मृत भ्रूण को तुरंत हटाया जाना चाहिए करने के लिए संक्रमण से बचने के के लिए.
    यदि सेल संस्कृति इन्क्यूबेटरों उपयोग किया जाता है, जो भली भांति बंद करके बंद कर रहे हैं, हे 2 आपूर्ति भ्रूण मर नहीं के लिए अनिवार्य है. आर्द्रता आवश्यक है के लिए सीएएम सूखी बाहर नहीं और अगर ऊष्मायन तापमान 37 से कम है ° सी, भ्रूण भी धीरे धीरे विकास होगा.

भाग 3: पदार्थों के angiogenesis assays के लिए आवेदन

  1. Autoclaved मुड़ा फिल्टर कागजात (5व्यास में 0.5 मिमी) एक छेद छेदने का शस्र द्वारा छिद्रित हैं और सांचा के लिए लागू तरल पदार्थ के लिए सामग्री (वाहक) का समर्थन के रूप में इस्तेमाल किया.
    नोट: लगभग प्रत्येक वाहक सामग्री (नीचे तालिका देखें) सीएएम की जलन के कारण होता है, खासकर जब ऊष्मायन 10 दिन पहले लागू है, क्योंकि यह विकासशील सीएएम पोत वास्तुकला बदल. यह भी शामिल hydroxyethyl सेलूलोज़ पन्नी की तरह संभावित अक्रिय पदार्थ, Teflon (PTFE - pledgets) स्पंज, कोलेजन स्पंज, कोलेजन पन्नी, बाँझ धुंध (swabs), दौर कवर फिसल जाता है, और सिलिकॉन के छल्ले, जो सभी झूठी सकारात्मक परिणाम के कारण. फिल्टर पेपर के लिए कम से कम जलन पैदा करने के लिए लग रहा था और इसलिए हमारे assays में प्रयोग किया जाता था.
  2. जब सीएएम पूरी तरह से विकसित की है, ऊपर से 6 अलग नमूने और लागू किया जा सकता है एक एकल सांचा पर उनके प्रभाव की तुलना में किया जा सकता है है.
  3. फिल्टर अतिरिक्त खुराक (3 μg देशी angiotropin) या बफर (5 μl पीबीएस) सुखाने से बचने के हर दिन फिर से लागू किया जाना चाहिए.
  4. आवेदन के बाद 3 दिन से, रक्त वाहिकाओं फिल्टर पर angiogenic पदार्थों की ओर मालूम है, जबकि नियंत्रण आसपास रक्त वाहिकाओं के पैटर्न अपरिवर्तित है.
    नोट: सीएएम जर्दी-बोरी के लिए गलत नहीं किया जाना चाहिए. सीएएम एक गतिशील विकासशील संरचना है जबकि जर्दी बोरी विकास के दौरान थोड़ा प्रसरण के साथ स्थिर है. विकासशील तीन दिन में सांचा विकासशील भ्रूण की दुम अंत में पहली बार के लिए किया जा सकता है एक छोटे से पुटिका के रूप में मान्यता प्राप्त है. तीन दिन और दस दिन के बीच प्रारंभिक पुटिका फैलता है, एक जोड़ दो स्तरित एक बढ़ती दर पर जर्दी बोरी overgrowing झिल्ली बनाने. आवेदन साइट के रूप में अन्यथा भ्रूण प्रेषित प्रकाश में प्रभाव का सूक्ष्म अवलोकन hinders सीएएम (सीमा) के भ्रूण और गुना के बीच आधे रास्ते जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, angiogenic पदार्थ के साथ फिल्टर जब सीएएम बढ़ती रहती भली भाँति है.

भाग 4: कक्षों की सीएएम पर टीका

कक्षों की 4.1.Preparation

  1. मिला हुआ कोशिकाओं को एक बाँझ 25 मिलीलीटर की प्लास्टिक एक विंदुक सहायता का उपयोग विंदुक के उपयोग द्वारा संस्कृति कुप्पी से फाल्कन ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.
  2. सेल संख्या का अनुमान करने के लिए, सेल निलंबन के 15 μl NEUBAUER कक्ष में स्थानांतरित कर रहा है और मैन्युअल रूप से एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं गिना जाता है.
  3. फाल्कन ट्यूबों 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1000 rpm पर centrifuged हैं और सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है.
  4. सेल रहते हैं पर नज़र रखने के लिए, कोशिकाओं पीबीएस के साथ वांछित एकाग्रता (यहाँ: 2x10 7 कोशिकाओं / एमएल) पतला कर रहे हैं और PKH26 जैसे (सिग्मा), एक लाल फ्लोरोसेंट रहते हैं कोशिका झिल्ली लेबलिंग किट साथ दाग 'निर्माताओं प्रोटोकॉल के अनुसार, .
    इंजेक्शन के लिए वांछित एकाग्रता (10 7 / सेल मिलीलीटर) या टीका (3x10 6 सेल मिलीलीटर /); कोशिकाओं रहे हैं सेल संस्कृति माध्यम (DMEM preferentially Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) में फिर से निलंबित कर दिया. विभिन्न सेल सांद्रता इंजेक्शन बनाम टीका के लिए पहले से ही 15-17 साहित्य और हमारे अनुभव में प्रकाशित सांद्रता के अनुसार लागू कर रहे हैं.

सीएएम पर कोशिकाओं के 4.2 टीका

  1. रिंगों (~ 1mm मोटाई) एक 1ml विंदुक टिप या एक परिधीय शिरापरक (PVL) ट्यूब कैथेटर से एक तेज स्केलपेल के उपयोग से काट रहे हैं और एक E6-E14 लड़की भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व ओवो सांचा के लिए लागू होता है.
    नोट: कई बार "देखा" लेकिन विंदुक या एक साथ कैथेटर ट्यूब टिप के माध्यम से कटौती नहीं की कोशिश करो एक नया, बहुत तेज स्केलपेल का उपयोग करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप के छल्ले पर तेज किनारों से बचने में कटौती. तेज किनारों के लिए सूक्ष्म दरारें से उत्पन्न खुर्दबीन के नीचे के छल्ले की जाँच करें.
  2. के छल्ले के आकार पर निर्भर करता है 3x10 / 6 सेल मिलीलीटर कोशिकाओं के 20 μl कुल में रिंग में एक या एकाधिक के छल्ले में विभाजित मात्रा के रूप में pipetted हैं.
    नोट: कुछ मामलों में कोमल scraping द्वारा सीएएम के traumatisation एक पूर्व अपेक्षित, 17 कोशिकाओं और grafts के capillarisation (नीचे देखें) का टीका की सुविधा जैसे है . अगर, हालांकि, सीएएम के traumatisation इरादा है या नहीं contraindicative, ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक क्षमता के अध्ययन के लिए जैसे, अंगूठियां टीका के लिए नहीं किया जा इस्तेमाल किया जाना चाहिए है, लेकिन कोशिकाओं के छल्ले या छल्ले के आवेदन के रूप में सीधे लागू किया जाना चाहिए स्वयं सूक्ष्म घाव पैदा हो सकता है . यदि छल्ले इस्तेमाल किया जाता है, इन के रूप में संभव के रूप में पतली के लिए वजन कम करने और सीएएम के खरोज से बचने के लिए कटौती की जानी चाहिए.

भाग 5: कोशिकाओं के Intravitreous इंजेक्शन

  1. एक हैमिल्टन microliter सिरिंज 70% और बाँझ पीबीएस के साथ अंत में EtOH के साथ कई बार rinsed है.
  2. सूक्ष्म सिरिंज तैयार दाग या बेदाग सेल निलंबन (पार्ट 4.1 देखें) से भरा है.
    नोट: इंजेक्शन साइट को ध्यान से चुना जा सुई के साथ प्रवेश पर भ्रूण (brain!) के सीएएम या आसन्न संरचनाओं की रक्त वाहिकाओं घायल नहीं है. इंजेक्शन एक विच्छेदन द्विनेत्री के तहत किया जाना चाहिए.
  3. खुर्दबीन नियंत्रण के तहत, ध्यान से, लेकिन जल्दी और सिरिंज सुई के साथ सांचा आँख परतों घुसना और लगातार अधिक से अधिक 20 μl सेल (preferentially पीबीएस में पतला) निलंबन लड़की भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व ओवो के शीशे में से 10 इंजेक्षन.
    नोट: यदि सीएएम सुई के साथ penetrated नहीं कर सकते हैं, यह धीरे यह फाड़ दो संदंश के साथ अलग से कुछ या कोई रक्त वाहिकाओं के साथ एक साइट पर हटा दिया हो सकता है.
  4. सुई 1-2 सेकंड आंख में रहने के लिए रिसाव के द्वारा इंजेक्शन सेल निलंबन के नुकसान से बचना चाहिए.

भाग 6: चिकन अंग कलियों के विच्छेदन

  1. अंडे इनक्यूबेटर से हटा रहे हैं ऊष्मायन 3 से 4 दिनों के बाद (E3/E4 = हैम्बर्गर हैमिल्टन (एच एच) stage18 23)
  2. अंडे एक त्रिकोणीय चुंबकीय हलचल पट्टी के किनारे पर टूट रहे हैं और एक पेट्री डिश (विवरण: भाग 2 देखें) में स्थानांतरित और भ्रूण वसंत कैंची का उपयोग चक्र काटने से कनेक्टेड जर्दी वाहिकाओं से dissected है.
  3. भ्रूण एक ताजा पेट्री एक छोटी सी नाली चम्मच के उपयोग से ठंड, बाँझ पीबीएस से भरा पकवान करने के लिए स्थानांतरित कर रहा है और तरह के आंदोलन से धोया.
  4. भ्रूण एक बाँझ पीबीएस से भरा है और झिल्ली से मुक्त छोटे पेट्री डिश को सौंप दिया है, ध्यान से उन्हें फाड़ ठीक संदंश के साथ अलग.
  5. अंग कलियों microsurgical संदंश द्वारा के रूप में संभव के रूप में शरीर के करीब अलग कर रहे हैं, समझा और एक 8 10 दिन पुरानी मेजबान चिकन सुसंस्कृत पूर्व ओवो (प्रक्रिया कलम बांधने का काम) के सीएएम को हस्तांतरित.

भाग 7: माउस अंग अंकुरित की तैयारी

  1. समय गर्भवती matings ऊपर सेट कर रहे हैं और दिन की सुबह जिस पर एक योनि प्लग महिलाओं संभोग में पता चला है हमल दिन 0 नामित है.
  2. गर्भवती महिला के गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था जब भ्रूण दिन भ्रूण के विकास (ई) 10 13 पर पहुंच गया और एक मोम बोर्ड पर निर्धारित द्वारा बलिदान है.
  3. पेट की दीवार ETOH 70% के साथ सिक्त है, midline साथ में कटौती करने के लिए और त्वचा flaps laterally पिन के द्वारा तय कर रहे हैं.
  4. गर्भाशय के दोनों सींग पेट, अलग और ठंड पीबीएस के साथ एक बीकर को हस्तांतरित से हटा रहे हैं.
  5. भ्रूण अलग, एक पेट्री डिश और गर्भाशय की दीवार को हस्तांतरित कर रहे हैं और भ्रूण झिल्ली ध्यान संदंश के उपयोग द्वारा हटा रहे हैं.
  6. अंग कलियों वसंत कैंची का उपयोग करके काट रहे हैं या शरीर के लिए संभव के रूप में करीब के रूप में ठीक संदंश द्वारा अलग, समझा और का सांचा को हस्तांतरित 8 10 दिन पुरानी मेजबान चिकन सुसंस्कृत पूर्व ओवो (प्रक्रिया कलम बांधने का काम देखें).

8: भाग ट्यूमर के नमूनों का संग्रह

  1. ट्यूमर बायोप्सी 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूमर सेल विशिष्ट संस्कृति माध्यम से भरा ट्यूबों (यहाँ: लेबोविट्ज़ मध्यम) में एकत्र कर रहे हैं और कमरे के तापमान पर रखा.
  2. ट्यूमर बायोप्सी 1-2 mm3 टुकड़ों में बाँझ नलियां द्वारा काट रहे हैं.
    नोट: यदि ट्यूमर के नमूनों बहुत छोटे थे, वे सांचा के लिए नहीं देते हैं, अगर वे भी बड़े थे, सीएएम और घायल हो सकता है भ्रूण मर सकता है.
  3. बायोप्सी नमूना की कोर से एक टुकड़ा की सांचा पर grafted है 8 10 दिन पुरानी मेजबान चिकन सुसंस्कृत पूर्व ओवो (प्रक्रिया कलम बांधने का काम देखें).
    नोट: बायोप्सी की सतह से सामग्री लेना मांसपेशियों या संयोजी ऊतक के साथ संदूषण का जोखिम बढ़ जाता है .

भाग 9: प्रक्रिया कलम बांधने का काम

  1. अंग कलियों या ट्यूमर नमूनों, 8-10 दिन की उम्र में लड़की भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व ओवो प्रयोग किया जाता है पूरी तरह से विकसित सीएएम की कलम बांधने का काम के लिए.
  2. grafts के आदर्श सांचा पर एक रक्त वाहिका का एक वाई विभाजन के पास रखा जाता है.
  3. वांछित आवेदन साइट पर, सीएएम चुनिंदा कोमल scraping (संदंश) बंद डबल उपकला परत के ऊपरी peridermal भाग से आघात है, बेसल परत बरकरार जा.
    नोट: यह करने के लिए खून बह रहा है या capillaries की दिखाई टूटना से बचने के लिए आवश्यक है.
  4. भ्रष्टाचार न्यूनतम पीबीएस संलग्न के साथ सांचा को सौंप दिया है. भ्रष्टाचार के आधार पर, यह सीएएम, जहां कोई कलम बांधने का काम अंतिम अत्यधिक पीबीएस निकालने के लिए इरादा है और फिर अंत में तैयार आघात सांचा साइट पर grafted की एक साइट पर एक या दो बार रखा हो सकता है.
  5. भ्रष्टाचार ठीक संदंश से समझा है और सांचा पर स्तरित. भ्रष्टाचार की संवेदनशीलता पर निर्भर करता है, प्रकाश दबाव सीएएम के परिणामस्वरूप इंडेंटेशन में भ्रष्टाचार पैंतरेबाज़ी करने के लिए (अंग कलियों के लिए उपयुक्त नहीं) लागू हो सकता है (ट्यूमर के नमूनों के लिए उपयुक्त) .
    नोट: के रूप में प्रतिरक्षा प्रणाली लड़की भ्रूण (ई) दिन 18 पर विकसित, पूर्व ओवो xenografts संस्कृतियों E17 परे नहीं जा लंबे समय तक के रूप में मेजबान लड़की भ्रूण अक्सर मरने चाहिए.
    यह महत्वपूर्ण है के लिए उपलब्ध मेजबान CAMs, क्रमशः लड़की भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व ओवो, अपनी पसंद के दाता ऊतक के एक स्रोत के साथ मेल खाना करने के लिए समय है.

भाग 10: पुनः - कलम बांधने का काम

  1. मेजबान लड़की भ्रूण शिरच्छेद द्वारा मार डाला है.
  2. साथ सांचासंलग्न भ्रष्टाचार बताया कैंची के साथ एक परिपत्र कटौती से हटा दिया है और एक पेट्री पीबीएस के साथ भरा पकवान को हस्तांतरित है.
  3. पूर्व अनुलग्नक साइट के लिए छोड़कर अत्यधिक सीएएम भ्रष्टाचार से वसंत कैंची द्वारा काट रहा है.
  4. बड़ा ट्यूमर के नमूनों के मामले में भ्रष्टाचार आधा या कई छोटे टुकड़ों में काट रहा है और फिर काटने बढ़त के साथ दूसरे मेजबान के नए सीएएम का सामना करना पड़ grafted.

भाग 11: प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1. शैल - कम चिकन संस्कृति
पेट्री डिश में विभिन्न विकास के चरणों सुसंस्कृत पूर्व ओवो चिकन भ्रूण.

चित्रा 2
चित्रा 2 पूर्व ओवो सीएएम angiogenesis को परख.
निषेचित चिकन अंडे क्षैतिज 37 डिग्री सेल्सियस और नमी 60 की - 62% में incubated रहे थे और भ्रूण 4 दिन (E4) में पेट्री डिश में फटा. ऊष्मायन एक ही परिस्थितियों में जारी किया गया था. E10 बाँझ फिल्टर कागजात (व्यास में 5.5 मिमी) से कम सीएएम के शीर्ष पर स्तरित थे और या तो 5 μl पीबीएस या 3 angiotropin6 देशी μg के साथ भिगो. Capillaries E14 पर angiotropin लथपथ फिल्टर पेपर की ओर स्पष्ट संरेखण दिखाया.

चित्रा 3
चित्रा 3 पूर्व अंग कलियों की कलम बांधने का काम ओवो
(E3/E4) लड़की और माउस (E13) से अंग कलियों खोल कम चिकन संस्कृतियों का सांचा पर grafted थे. सीएएम से रक्त वाहिकाओं के दो दिन बाद अंग कलियों में प्रवेश किया. अंग कलियों के विकास के इन पूर्व ओवो संस्कृतियों लड़की में एक दो अऋगुली की पोर मंच तक पहुँचने और murine अंग कलियों में interdigital जाले की कमी प्रदर्शित में जारी रखा.

चित्रा 4
चित्रा 4 ट्यूमर के नमूने के पूर्व ओवो टीका .
मूत्राशय कार्सिनोमा के एक बायोप्सी नमूना एक 10 दिन पुरानी लड़की भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व ओवो के सीएएम पर inoculated किया गया था. संस्कृति में दो दिनों के बाद, ट्यूमर नमूना सीएएम vasculature को जुड़ा था और 7 दिनों के बाद, कई रक्त वाहिकाओं भ्रष्टाचार में प्रवेश मनाया गया.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

अभिनव या सिर्फ एक लड़की संस्कृति प्रोटोकॉल?

पूर्व खोल - कम संस्कृति प्रोटोकॉल के साथ 1-4 लड़की भ्रूण की कुल जीवित रहने की दर कम थे, जैसे ca . 30% 1. परिष्कृत पूर्व ओवो संस्कृति इस वीडियो लेख में वर्णित प्रोटोकॉल, इसके विपरीत द्वारा, 50% से अधिक जीवित रहने की दरों के लिए अनुमति देता है. ओवो संस्कृतियों में शास्त्रीय तुलना लड़की भ्रूण की पूर्व ओवो संस्कृति काफी सीएएम और लड़की भ्रूण की पहुंच की सुविधा है और उनके प्रयोगात्मक हेरफेर और सतत निगरानी के लिए सक्षम बनाता है. यह संस्कृति विधि बढ़ाया angiogenesis 5,6 लड़की भ्रूण 7-9 आँख के शीशे, intravasation assays 10-12 में मदद इंजेक्शन को assays, से लेकर आवेदन की एक विस्तृत विविधता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कलम बांधने का काम और अंग 13 कलियों के विकास में सुधार और ट्यूमर के 14 नमूनों की अभिनव रखरखाव. इस प्रकार, पूर्व ओवो संस्कृति विकास angionesis, और ट्यूमर के अनुसंधान में एक उपयोगी उपकरण योगदान देता है .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

लेखकों के उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और प्रो Ruebben के लिए उदारता ट्यूमर सामग्री की आपूर्ति के लिए जे Kueper जे Wittschier धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
  2. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
  3. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
  4. Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
  5. Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
  6. Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
  7. Kistler, H. B. J. r., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
  8. Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
  9. Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
  10. Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
  11. Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. (2008).
  12. Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
  13. Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4, (3), 881-883 (1978).
  14. Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
  15. McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).
  16. Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).
  17. Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
चिकी<em> पूर्व ओवो</em> संस्कृति और<em> पूर्व ओवो</em> सीएएम परख: यह कैसे सच में काम करता
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter