La membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM) est un environnement unique et naturellement immunodéficients culture favorable pour étudier l'angiogenèse et de la tumorigenèse. Cet article vidéo montre les différentes étapes de poussin<em> Ovo ex</em> Culture, à l'application de substances potentiellement angiogéniques et l'inoculation des cellules tumorales avec succès et les tissus sur la surface de la came.
Les œufs de poule dans la première phase de reproduction sont entre données in vitro et in vivo et de fournir un environnement de test vasculaire non seulement d'étudier l'angiogenèse mais aussi d'étudier la tumorigenèse. Après que la membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM) a mis au point, son réseau de vaisseaux sanguins peut être facilement accessible, manipulé et observé et permet donc un réglage optimal pour les essais d'angiogenèse. Comme le système lymphoïde n'est pas complètement développée jusqu'aux stades tardifs de l'incubation, l'embryon de poulet sert d'hôte immunodéprimé naturellement capable de soutenir les tissus et les cellules greffées sans restrictions spécifiques à l'espèce. En plus de nourrir le développement d'allo-et xénogreffes, le réseau de vaisseaux sanguins CAM offre un contexte favorable à la intravasation cellules tumorales, la diffusion et l'arrestation vasculaire et un référentiel dans lequel les cellules arrêtées s'extravaser pour former des micro foyers métastatiques.
À des fins expérimentales, en moer des études récentes, le CAM a été exposée en coupant une fenêtre à travers la coquille d'oeuf et expériences ont été réalisées in ovo, ce qui entraîne des limitations significatives dans l'accessibilité de la CAM et possibilités pour l'observation et la documentation photographique des effets. Quand le shell-moins des cultures de l'embryon de poulet ont été utilisés 1-4, pas de détails expérimentaux ont été fournis et, si publiées, les taux de survie de ces cultures étaient faibles. Nous avons affiné la méthode de culture in ovo ex d'embryons de poulet de façon significative par l'introduction d'une extrusion contrôlée rationnelle de la teneur en œuf. Ces cultures ex ovo améliorer l'accessibilité de l'embryon CAM et Chick, ce qui permet facilement dans la documentation in vivo des effets et de faciliter la manipulation expérimentale de l'embryon. Cela permet à l'application réussie d'un grand nombre de questions scientifiques: (1) Comme un essai d'angiogenèse amélioration de 5,6, (2) un dispositif expérimental mis en place pour les injections de faciliter l'établissement ee vitré de l'oeil d'embryon de poulet 7-9, (3) comme un environnement de test pour la diffusion et la dispersion de intravasation cellules tumorales à partir de lignées cellulaires établies inoculées sur la CAM, 10-12 (4) en tant que système de maintien amélioré pour la transplantation réussie et culture de bourgeons de membres de poulet et 13 souris ainsi que (5) pour le greffage, de propagation, et de nouveau la greffe de tissu tumoral solide primaire obtenu à partir de biopsies de la surface de la came 14.
Dans cet article, nous décrivons la vidéo mise en place d'une culture raffinée poussin ex ovo et le dosage CAM avec des taux de survie de plus de 50%. En plus nous offrons une démonstration étape par étape de l'application réussie de la culture ex ovo pour un grand nombre d'applications scientifiques.
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, et Sebastian Gustmann contribué également à cette étude.
Novateur ou juste un autre protocole de culture poussin?
Avec les anciens protocoles de culture sans coquille 1-4 le taux de survie total des embryons de poulet ont été faibles, par exemple ca. 30% 1. Le protocole ex ovo culture raffinée décrit dans cet article la vidéo, en revanche, permet des taux de survie de plus de 50%. Par rapport à la musique classique dans des cultures in ovo culture ex ovo d'embryons de poulet facil…
Les auteurs tiennent à remercier J. et J. Kueper Wittschier d'assistance technique excellente et le professeur Ruebben pour alimenter généreusement matériel tumoral.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
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70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |