Das Küken Chorioallantoismembran (CAM) ist eine einzigartige, natürlich immundefizienten unterstützende Kultur Umwelt, die Angiogenese und Tumorentstehung zu untersuchen. Dieses Video Artikel zeigt die verschiedenen Schritte in chick<em> Ex ovo</em> Kultur, Anwendung von potenziell angiogenen Substanzen und erfolgreiche Impfung von Tumorzellen und Gewebe auf der Oberfläche der CAM.
Hühnereier in der frühen Phase der Zucht sind zwischen in vitro und in vivo-Systeme und eine vaskuläre Testumgebung nicht nur die Angiogenese zu studieren, sondern auch zu Tumorgenese zu studieren. Nach dem chick Chorioallantoismembran (CAM) entwickelt hat, kann seine Blutgefäß-Netz leicht zugänglich, manipuliert und beobachtet und bietet somit eine optimale Einstellung für die Angiogenese-Assays. Da das Lymphsystem ist nicht vollständig bis in den späten Stadien der Inkubationszeit entwickelt, dient der Hühnerembryo als natürlich immundefizienten Host in der Lage ist, ein dauerhaftes veredelt Gewebe und Zellen ohne artspezifische Einschränkungen. Neben der Pflege der Entwicklung allo-und Xenotransplantate, bietet die CAM Blutgefäß-Netz ein einzigartiges Umfeld für Tumorzellen intravasation, Verbreitung und vaskuläre Verhaftung und ein Repository, in dem arretierten Zellen extravasieren zu Mikro Metastasenherde bilden.
Für experimentelle Zwecke in den meisten der jüngsten Studien der CAM wurde, indem ein Fenster, durch die Eierschale und Experimente wurden in ovo durchgeführt, was zu erheblichen Einschränkungen in der Erreichbarkeit der CAM und Möglichkeiten für die Beobachtung und Fotodokumentation von Einflüssen ausgesetzt. Wenn Shell-less Kulturen der Hühnerembryo 1-4 wurden verwendet, keine experimentellen Angaben gemacht wurden und, wenn überhaupt veröffentlicht wurde, waren die Überlebensraten von diesen Kulturen gering. Wir verfeinerten die Methode der ex ovo Kultur der Hühnerembryonen signifikant durch die Einführung einer rational gesteuerten Extrusion der Ei Inhalte. Diese ex ovo Kulturen verbessern die Erreichbarkeit der CAM-und Hühnerembryonen, so dass in vivo Dokumentation der Effekte einfach und erleichtert experimentelle Manipulation des Embryos. Dies ermöglicht den erfolgreichen Einsatz einer großen Anzahl von wissenschaftlichen Fragestellungen: (1) Als eine verbesserte Angiogenese-Assay 5,6, (2) einen experimentellen Aufbau für einen erleichterten Injektionen in den Glaskörper des Hühnerembryo Auge 7-9 eingestellt, (3) als Testumgebung für die Verbreitung und intravasation verstreuter Tumorzellen aus etablierten Zelllinien auf der CAM 10-12 geimpft, (4) eine verbesserte tragendes System für eine erfolgreiche Transplantation und Kultur der Gliedmaßen von Hühnern und Mäusen 13 sowie (5 ) für die Transplantation, die Ausbreitung und Re-Transplantation von soliden primären Tumorgewebe von Biopsien auf der Oberfläche der CAM 14 erhalten.
In diesem Video-Artikel beschreiben wir die Einrichtung eines raffinierten chick ex ovo Kultur und CAM-Assay mit Überlebensraten von über 50%. Außerdem haben wir eine Schritt für Schritt Demonstration der erfolgreichen Anwendung der ex ovo Kultur für eine große Anzahl von wissenschaftlichen Anwendungen.
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, und Sebastian Gustmann trugen gleichermaßen zu dieser Studie.
Innovative oder nur ein weiteres Küken Kultur-Protokoll?
Mit dem ehemaligen Shell-less Kultur Protokolle 1-4 Die gesamte Überlebensrate der Hühnerembryonen waren niedrig, zB ca. 30% 1. Die raffinierte ex ovo Kultur-Protokoll in diesem Video Artikel beschrieben, hingegen ermöglicht die Überlebensraten über 50%. Im Vergleich zu klassischen in-ovo-Kulturen ex ovo Kultur der Hühnerembryonen erleichtert erheblich die Erreichbarkeit der CAM-und Hühne…
Die Autoren bedanken sich bei J. Kueper und J. Wittschier für hervorragende technische Unterstützung und Prof. Ruebben danken für die großzügige Bereitstellung Tumormaterial.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
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70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |