Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

אפרוח אובו לשעבר תרבות אובו לשעבר CAM Assay: איך זה באמת עובד

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

Chorioallantoic חומוס קרום (רמ"א) הוא ייחודי, immunodeficient באופן טבעי בסביבה תומכת תרבות ללמוד אנגיוגנזה tumorigenesis. מאמר זה וידאו מדגים את השלבים השונים חומוס

Abstract

ביצים עוף בשלב מוקדם של הגידול הם בין במבחנה מערכות vivo ולספק סביבת מבחן כלי הדם לא רק ללמוד אנגיוגנזה אלא גם ללמוד tumorigenesis. לאחר קרום chorioallantoic חומוס (רמ"א) פיתחה, כלי הדם שלה ברשת ניתן לגשת בקלות, מניפולציות נצפתה ולכן מספק הגדרה אופטימלית עבור מבחני אנגיוגנזה. מאז מערכת הלימפה אינה מפותחת עד בשלבים המאוחרים של דגירה, הגוזל את העובר משמש כמארח immunodeficient טבעי המסוגל לקיים רקמות ותאים מורכבים ללא מינים ספציפיים הגבלות. בנוסף לטיפוח פיתוח Allo ו xenografts, רשת כלי הדם CAM מספק סביבה תומכת באופן ייחודי עבור intravasation תא הפצת גידול, ולעצור את כלי הדם ומאגר שבו תאים נעצר extravasate כדי ליצור מיקרו גרורתי מוקדים.

לצורך הניסוי, ברוב המחקרים האחרונים CAM נחשף על ידי חיתוך חלון דרך הקליפה ביצה הניסויים בוצעו אובו, וכתוצאה מכך מגבלות משמעותיות בנגישות של CAM ואת אפשרויות התצפית ותיעוד תמונה של אפקטים. כאשר פגז פחות תרבויות של העובר גוזל שימשו 1-4, לא נמסרו פרטים ניסיוני, ואם פירסם בכלל, שיעורי ההישרדות של תרבויות אלה היו נמוכים. מיקדנו את השיטה של התרבות אובו לשעבר של עוברים חומוס באופן משמעותי על ידי החדרת שחול נשלט באופן רציונלי של תוכן הביצה. אלו תרבויות אובו לשעבר לשפר את הנגישות של העובר CAM ו האפרוח, המאפשר קל בתיעוד vivo של תופעות והקלה מניפולציה ניסויית של העובר. זה מאפשר יישום מוצלח למספר רב של שאלות מדעיות: (1) החל assay אנגיוגנזה משופרת 5,6, (2) ניסיוני להגדיר עבור זריקות בהנחייתם של הזגוגית של העין חומוס העובר 7-9, (3) כמו סביבת מבחן להפצת ו intravasation של פיזור תאים סרטניים של שורות תאים הוקמה מחוסן על CAM 10-12, (4) כמערכת בשמירה משופרת עבור השתלה מוצלחת של תרבות ניצנים איבר של עוף ועכברים 13 וכן (5 ) עבור השתלת, התפשטות, מחדש השתלת רקמת מוצק הגידול הראשוני המתקבל ביופסיות על פני השטח של CAM 14.

במאמר זה אנו מתארים וידאו הקמתה של תרבות לשעבר מעודן חומוס אובו ו assay CAM עם שיעורי ההישרדות מעל 50%. מלבד זאת אנו מספקים צעד אחר צעד הפגנה של יישום מוצלח של התרבות אובו לשעבר למספר רב של יישומים מדעיים.


דניאל ס Dohle, סוזן ד Pasa, וסבסטיאן Gustmann תרמו באופן שווה על מחקר זה.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הציוד ריאגנטים צריך להיות סטרילי לרכוש או צריך להיות חום או קיטור מעוקר או מעוקר עם ETOH 70%.

המדינה המחברים כי ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם הקהילות האירופיות Council Directive (86/609/EEC), בעקבות הנחיות של NIH לגבי טיפול השימוש בבעלי חיים הפרוצדורות והתקנות שנקבעו על ידי בעלי חיים המוסדי טיפול השתמש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת דואיסבורג-אסן (גרמניה).

חלק 1: דגירה של ביצים

  1. ביציות מופרות יכול להיות מאוחסן על 13 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
  2. ביצים מודגרת למשך 72 שעות, שוכב אופקית באינקובטור עם מגש נע, סיבוב ביצים 12 פעמים ביום ברציפות. לחות נשמר ב 60 - 62%, טמפרטורת הדגירה על 37.5 ° C.
    הערה: לפני שמתחילים דגירה, לכלוך, צואה נוצות מוסרים בזהירות מן קליפות ביצים מכנית ידי ניגוב יבש עם משותף, אפור יד זיגזג מגבות נייר, אשר יש מחוספס ולא מבנה משטח רך. ניגוב ביצים עם אתנול או חיטוי, לעומת זאת, הקטינה באופן משמעותי שיעור ההישרדות של העוברים, ללא קשר נוזל המשמש.

חלק 2: תרבות אובו אקס

  1. לאחר הדגרה למשך 72 שעות, ביצים יוסרו מן החממה.
    הערה: ביצים מודגרת למשך 72 שעות, כי על - פי הניסויים שלנו - מסיבות לא ידועות, אך בהסכם עם אורבך ואחרים בשלבי פיתוח al.1 קודם לכן שיעורי הישרדות נמוכים משמעותית. בשלבים מאוחרים יותר מ -72 שעות את שק החלמון אשר אינו מכוסה על ידי רמ"א עדיין הופך דק יותר נוטה לדבוק מעטפת הביצית המובילים (i) ושטפי דם קטנים באזור של דבקות (ii) הקרע של שק החלמון הממברנה. לכן השיטה הציג אינו ישים עוברים יותר מ 72 שעות.
  2. הצד העליון של ביצים, שבו העובר שוכן, מסומן על ידי עיפרון מאז העובר מתנגד סיבוב במידה מסוימת.
  3. הביצית מוחזקת אופקית עם סימן העיפרון על גבי וסדוקות על קצה 80 מ"מ משולש בר ומערבבים מגנטי בכיוון הנחת בניצב לציר הארוך של הביצה.
    הערה: לקבלת תחושה טובה יותר, ללא כפפות אמור לשמש, אבל הידיים יש לחטא עם EtOH 70%. חשוב כי פגז ביצה, כמו גם את קרום הביצה הם פתחו. דולף של חלבון ביצה הוא סימן בטוח כי קרום ביצה כבר מחורר.
  4. הביצית נשמרת קרוב לתחתית צלחת פטרי, כדי למנוע דליפה נוספת של חלבון ביצה.
    הערה: במהלך ההליך הפתיחה הראשונית, חשוב כי חלבון ביצה על החלק התחתון של צלחת פטרי עדיין מחובר לשאר בתוך הביצה כתוצאות זה בוואקום בתוך הביצה אשר מחזיקה את החלמון עם העובר על גבי בתוך את הביצה. ריק יכול להיות מוסדר באמצעות לחץ אצבע השולטת כניסת אוויר לתוך הביצה או על ידי הרמת ביצה אשר מגביר את הטור של מחובר ביצה כלומר ואקום.
  5. על ידי הפעלת לחץ בעדינות על מרידיאן רץ דרך הסדק קו המשווה של הביצה על ידי האגודל האצבעות האמצעיות ניתן לווסת את הואקום. התוכן של הביצה לאחר מכן ניתן להעביר צלחת פטרי ניזוק, אם ביצה עם חלמון הוא הרים בעדינות את שני חצאי הקליפה מופרדים בקפידה. העובר וכלי חלמון צריך לשכב על גבי החלמון ניזוק.
    הערה: אם את סימן העיפרון לא נשמר על גבי, העובר עלול להיפגע כאשר פיצוח הקליפה. אם הביצים אינן סדוקות בזהירות מספיק או העוברים הם בני יותר מ 72 שעות (ראה לעיל), שק חלמון מקלות על הקליפה ולעיתים קרובות נקרע. אותו הדבר קורה כאשר הלחות של החממה נמוך מ 60% או ביצים אינן מסובבות במהלך הדגירה.
  6. תרבויות אובו אקס מוחזרים באינקובטור ושמר על 37.5 ° 38.2 ° C ו 60% לחות. CO 2 או O 2 האספקה ​​אינו נחוץ אם האינקובטור אינו סגור הרמטית (רשת אוורור פתוחה חלקית!) ומיוחד צלחות פטרי עם מפרידי בין המכסה מאכל משמשים.
    הערה: העברת עוברים צריך להיות למינימום בימים הראשונים של דגירה. תוצאות תסיסה רבה מדי שיעורי תמותה גבוהים. מהיום הדגירה 9 ואילך, עוברים הם פחות רגישים תסיסה.
    עוברים המלח יש להסיר מיד כדי למנוע זיהומים.
    אם התרבות חממות התא משמשים, אשר סגורים הרמטית, O 2 האספקה ​​הינו חובה עבור עוברי לא למות. לחות חיונית CAM לא להתייבש אם טמפרטורת הדגירה נמוך מ 37 ° C, עוברים יפתחו לאט מדי.

חלק 3: יישום של חומרים עבור מבחני אנגיוגנזה

  1. Autoclaved ניירות לסנן מקופל (50.5 מ"מ קוטר) הם אגרוף על ידי אגרופן חור ושימש תמיכה החומר (הספק) של חומרים נוזליים להחיל CAM.
    הערה: כמעט כל חומר הספק (ראו טבלה להלן) גרמו לגירוי של CAM, במיוחד כאשר הם מיושמים לפני הדגירה 10 יום, כפי שהוא שינה כלי פיתוח ארכיטקטורה CAM. זו כללה גם חומרים אינרטי פוטנציאל כמו נייר תאית hydroxyethyl, ספוגים טפלון (PTFE-pledgets), ספוגים קולגן, לסכל קולגן, גזה סטרילית (דגימות), מחליק מכסה עגול, טבעות סיליקון, אשר גרמו כל תוצאות חיוביות כוזבות. נייר סינון נראה לגרום לגירוי לפחות ושימש ולכן מבחני שלנו.
  2. כאשר CAM היא מפותחת, עד 6 מדגמים שונים ניתן להחיל אפקטים שלהם ניתן להשוות על CAM יחיד.
  3. כדי למנוע התייבשות מסננים מנות נוספות (3 angiotropin מיקרוגרם native) או חיץ (5 PBS μl) צריך להיות מיושם מחדש מדי יום.
  4. מהיום 3 לאחר היישום, כלי דם להתמצא כלפי החומרים angiogenic על המסננים, בעוד דפוס של כלי דם המקיפים היא שולטת ללא שינוי.
    הערה: CAM לא צריך להיות בטעות שק החלמון. CAM הוא מבנה דינמי המתפתח ואילו שק החלמון הוא סטטי עם סטיות קטנות במהלך הפיתוח. ביום בפיתוח three CAM המתפתח ניתן להכיר בפעם הראשונה בסוף הזנב של העובר כמו שלפוחית ​​קטנה. בין יום שלוש עשר יום שלפוחית ​​הראשוני מתרחב, יצירת קרום מקופל דו שכבתית overgrowing את שק החלמון בקצב הולך וגובר. האתר היישום צריך להיות באמצע הדרך בין העובר לבין קפל של CAM (גבול) כמו אחרת העובר מעכבת תצפית מיקרוסקופית של השפעות האור המועבר. לחלופין, המסנן עם החומר angiogenic מופנם כאשר CAM ממשיך לגדול.

חלק 4: הרכבה של תאים על גבי CAM

4.1.Preparation של תאים

  1. תאים ומחוברות מועברים מן הבקבוק תרבות לצינורות FALCON על ידי שימוש פיפטה 25 מ"ל סטרילי הפלסטיק באמצעות סיוע פיפטה.
  2. כדי להעריך מספר תאים, 15 μl של השעיה התא מועבר לחדר Neubauer ותאי נספרות באופן ידני תחת מיקרוסקופ.
  3. צינורות פלקון הם centrifuged דקות 3 ב 1000 סל"ד בטמפרטורת החדר ואת supernatant נמחקת.
  4. למעקב תא חי, תאים מדולל PBS לריכוז הרצוי (כאן: 2x10 7 תאים / מ"ל) ו מוכתם למשל PKH26 (Sigma), קרום התא אדום ניאון לחיות ערכת תיוג, על פי פרוטוקול של היצרנים.
    תאים הם מחדש מושעה במדיום הסלולרי תרבות (מועדף מדיום שונה Dulbecco של הנשר; DMEM) לריכוז הרצוי להזרקה (10 7 תא / ml) או חיסון (3x10 6 תאים / מ"ל). ריכוזי תאים שונים מוחלים על זריקות חיסון נגד פי ריכוזי שפורסם כבר בספרות 15-17 והניסיון שלנו.

4.2 הרכבה של תאים על גבי CAM

  1. טבעות (~ בעובי 1 מ"מ) נחתכים מקצה פיפטה 1ml או צנתר ורידי צינור היקפי (PVL) על ידי שימוש בסכין מנתחים חדה להחיל CAM של E6-E14 עובר אפרוח אובו תרבותי לשעבר.
    הערה: נסו לא "ראו" מספר פעמים אך לחתוך קצה פיפטה או צינור הקטטר עם אחד לחתוך באמצעות אזמל חדש, חדה מאוד, כדי למנוע קצוות חדים על טבעות שהתקבל. בדוק את טבעות מתחת למיקרוסקופ על קצוות חדים הנובעים מיקרו סדקים.
  2. בהתאם לגודל של הטבעות 20 μl של 3x10 6 תאים / ml תאים pipetted בסך הכל לתוך טבעת אחת או כמו כרכים מחולקים טבעות מרובות.
    הערה: במקרים מסוימים של טראומה CAM על ידי גירוד עדין הוא תנאי מוקדם, למשל כדי להקל על הרכבה של תאים 17 ו capillarisation של שתלי (ראה להלן). אם, לעומת זאת, טראומה של רמ"א אינו מיועד או contraindicative, למשל ללימודי פוטנציאל פולשני של תאים סרטניים, טבעות לא אמור לשמש עבור חיסון, אבל תאים צריך להיות מיושם ישירות כיישום של טבעות או טבעות עצמם עשויים לגרום לפצע מיקרו . אם טבעות משמשים, אלה צריך להיות חתוך דק ככל האפשר כדי למזער את המשקל ולהימנע הכניסה של CAM.

חלק 5: הזרקה של תאים Intravitreous

  1. מזרק microliter המילטון היא שטפה מספר פעמים עם EtOH 70% ולבסוף עם PBS סטרילית.
  2. מזרק מיקרו מלא ההשעיה תא הכינו את מוכתם או בלא כתם (ראה פרק 4.1).
    הערה: באתר ההזרקה צריך להיות שנבחרו בקפידה, שלא לפגוע בכלי הדם של מבנים סמוכים או CAM של העובר (brain!) על ידי חדירה עם המחט. הזריקה צריך להיעשות תחת המשקפת לנתיחה.
  3. תחת שליטה מיקרוסקופ, בזהירות, אך במהירות לחדור את שכבות CAM עין עם מחט מזרק ברציפות להזריק 10 עד 20 ההשעיה המקסימלי תא μl (בדילול מעדיפים ב-PBS) לתוך הזגוגית של עובר אפרוח אובו תרבותי לשעבר.
    הערה: אם CAM לא יכול להיות חדר עם המחט, זה יכול להיות מוסר באתר עם ​​כלי דם או לא מעטים על ידי בעדינות קורעים אותו לגזרים עם שני מלקחיים.
  4. המחט צריכה להישאר 1-2 שניות לתוך העין, כדי למנוע אובדן של השעיה התא שהוחדר על ידי דליפה.

חלק 6: Dissection ניצנים של איבר עוף

  1. ביצים יוסרו מן החממה לאחר 3 עד 4 ימים של דגירה (E3/E4 = המבורגר המילטון (HH) stage18-23)
  2. ביצים סדוקות בקצה הבר ומערבבים משולש מגנטי והועבר לתוך צלחת פטרי (פרטים: ראה חלק 2) ואת העובר גזור מכלי חלמון מחובר על ידי חיתוך מעגל באמצעות מספריים האביב.
  3. העובר מועבר בצלחת פטרי טרי מלא קר, PBS סטרילי על ידי שימוש בכפית קטנה בריחת ושטף ידי תסיסה סוג.
  4. העובר מועבר בצלחת פטרי קטן מלא PBS סטרילית משוחררים ממברנות סביב, בזהירות לקרוע אותם לגזרים עם מלקחיים בסדר.
  5. ניצנים לימב מנותקים על ידי מלקחיים microsurgical קרוב לגוף ככל האפשר, תפס והועברו CAM של עוף 8-10 יום בן לארח אובו לשעבר תרבותי (ראה השתלת ההליך).

חלק 7: הכנת ניצנים איבר העכבר

  1. הזדווגויות זמן בהריון הן להגדיר את הבוקר של היום שבו תקע הנרתיק מזוהה ההזדווגות הנקבות מיועדת 0 יום ההריון.
  2. הנקבה בהריון היא הקריבה על ידי נקע בצוואר הרחם, כאשר התפתחות העוברים הגיע יום עובריים (E) 10-13 ו קבוע על לוח שעווה.
  3. דופן הבטן היא טבולה ETOH 70%, לחתוך לאורך קו האמצע לבין דשי העור קבועים רוחבית על ידי סיכות.
  4. שתי הקרניים של הרחם יוסרו מן הבטן, מנותקת והועברו מבחנה עם PBS קר.
  5. עוברים מופרדים, הועבר צלחת פטרי קיר הרחם והקרומים עובריים יוסרו בקפידה על ידי שימוש במלקחיים.
  6. ניצנים לימב נחתכים על ידי שימוש במספריים באביב או מנותקת על ידי מלקחיים קנס כאמור קרוב לגוף ככל האפשר, תפס והועברו CAM של 8-10 יום בן עוף מארח אובו תרבותי לשעבר (ראה השתלת ההליך).

חלק 8: איסוף דגימות הגידול

  1. ביופסיות גידול נאספים 2 צינורות מ"ל Eppendorf מלאים בינוני תא ספציפי הגידול התרבות (כאן: בינוני של ליבוביץ) ושמרו בטמפרטורת החדר.
  2. ביופסיות גידול נחתכות לתוך 1-2 mm3 יצירות של אזמלים סטרילית.
    הערה: אם דגימות הגידול היו קטנות מדי, הם עלולים שלא לצרף CAM, אם הם היו גדולים מדי, CAM עשוי להיות נפגע העובר עלול למות.
  3. חתיכה מליבה של המדגם ביופסיה שהושתל CAM של 8-10 יום בן עוף מארח אובו תרבותי לשעבר (ראה השתלת ההליך).
    הערה: נטילת חומר מפני השטח של הביופסיה מגדילה את הסיכון של זיהום עם שריר או רקמת חיבור.

חלק 9: השתלת נוהל

  1. לגבי השתלת איבר או ניצנים של דגימות הגידול, CAM מפותחת של 8-10 יום בן עוברי אפרוח אובו לשעבר תרבותי משמש.
  2. שתלי ממוקמים במיקום אידיאלי על CAM ליד הסתעפות Y של כלי דם.
  3. באתר את היישום הרצוי, CAM הוא טראומה סלקטיבי על ידי גירוד עדין מעל (מלקחיים) את החלק העליון של peridermal שכבת האפיתל כפול, עוזב את שכבת הבסיס ללא שינוי.
    הערה: זה חיוני כדי למנוע דימום או קרע גלוי של נימי דם.
  4. שתל מועבר CAM עם PBS מינימלי המצורפת. בהתאם השתל, זה יכול להיות ממוקם פעם או פעמיים באתר של רמ"א, שם לא סופי השתלת נועד להסיר PBS מופרז ואז מורכבים בסופו של דבר באתר CAM הכינו את טראומה.
  5. השתל הוא תפס ידי מלקחיים בסדר שכבתית על CAM. בהתאם לרגישות של השתל, לחץ קל יכול להיות מיושם (לא מתאים ניצנים איבר) כדי לתמרן את השתל לתוך חריץ כתוצאה של CAM (מתאים דגימות גידולים).
    הערה: כאשר מערכת החיסון מפתחת חומוס ביום עובריים (E) 18, לשעבר תרבויות xenografts אובו לא צריך להיות ממושך מעבר E17 כמו חומוס עוברים לארח לעתים קרובות למות.
    חשוב יש מצלמות מארח זמין, בהתאמה עוברי אפרוח אובו לשעבר תרבותי, מתוזמן כדי לחפוף עם מקור של רקמות התורם על פי בחירתך.

פרק 10: Re-השתלת

  1. העובר גוזל הפונדקאי הוא נהרג על ידי עריפת ראש.
  2. CAM עםשתל המצורף הוסר על ידי חתך עגול עם מספריים הצביע והועברו בצלחת פטרי מלאות PBS.
  3. CAM מוגזמת נחתך מן השתל על ידי מספריים באביב למעט באתר המצורף לשעבר.
  4. במקרה של דגימות הגידול גדול יותר, השתל הוא חתך חצאים או חתיכות קטנות מספר מחדש מורכבים עם חוד החנית מול CAM החדש של המארחת השנייה.

פרק 11: תוצאות נציג

איור 1
באיור 1. Shell פחות עוף תרבות
עוף עוברים בשלבים שונים של פיתוח אובו לשעבר תרבותי בצלחות פטרי.

איור 2
איור 2. Assay אקס אובו CAM אנגיוגנזה
ביצי תרנגולת מופרות הודגרו אופקית ב 37 מעלות ולחות של 60 - 62% וסדוקות לתוך צלחות פטרי ביום עובריים 4 (E4). הדגירה נמשכה תחת אותם תנאים. ב E10 ניירות סינון סטרילי (5.5 מ"מ קוטר) היו שכבות על גבי CAM ו ספוג או עם 5 PBS μl או 3 מיקרוגרם יליד angiotropin6. נימים הראה יישור ברור כלפי הנייר angiotropin ספוג לסנן על E14.

איור 3
איור 3. Ex אובו השתלת איבר של ניצנים
ניצנים לימב מ חומוס (E3/E4) ועכבר (E13) היו מורכבים על CAM של פגז פחות תרבויות עוף. כלי דם מן CAM נכנס ניצנים איבר אחרי יומיים. התפתחות ניצני איבר המשך אלה תרבויות אובו לשעבר להגיע השלב השני הפלנגות בתוך חומוס ולהציג ירידה של קורי interdigital ב ניצנים איבר Murine.

איור 4
איור 4. חיסון אובו אקס המדגם גידול
דגימת ביופסיה של סרטן שלפוחית ​​השתן היה מחוסן על CAM של 10 יום בן עובר אפרוח אובו תרבותי לשעבר. לאחר יומיים בתרבות, הדגימה את הגידול היה קשור vasculature CAM ואחרי 7 ימים, כלי דם מרובים להיכנס שתל נצפו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

חדשני או רק עוד פרוטוקול תרבות חומוס?

עם הקליפה פחות פרוטוקולים לשעבר תרבות 1-4 שיעורי ההישרדות הכולל של עוברי אפרוח היו נמוכים, כגון CA. 30% 1. לשעבר מעודן אובו תרבות פרוטוקול המתואר במאמר זה וידאו, לעומת זאת, מאפשר שיעורי ההישרדות מעל 50%. בהשוואה הקלאסית בתרבויות אובו אובו התרבות לשעבר של עוברים חומוס מקלה באופן משמעותי את הנגישות של העובר CAM ו האפרוח ומאפשר מניפולציה ניסויית שלהם ניטור רציף. שיטה זו תרבות יכולה לשמש במגוון רחב של יישומים, החל מבחני אנגיוגנזה מוגברת 5,6, זריקות כדי להקל על הזגוגית של העין חומוס העובר 7-9, מבחני intravasation 10-12, שיפור וצמיחה של השתלת איבר ניצנים 13 ותחזוקה חדשני של 14 דגימות הגידול. לפיכך, תרבות אובו לשעבר תורם כלי שימושי במחקר angionesis התפתחותית, ואת הגידול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות Kueper ג'וג' Wittschier לקבלת סיוע טכני מעולה פרופ Ruebben עבור בנדיבות באספקת חומר גידול.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
  2. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
  3. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
  4. Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
  5. Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
  6. Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
  7. Kistler, H. B. J. r., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
  8. Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
  9. Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
  10. Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
  11. Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. (2008).
  12. Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
  13. Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4, (3), 881-883 (1978).
  14. Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
  15. McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).
  16. Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).
  17. Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
אפרוח<em> אובו לשעבר</em> תרבות<em> אובו לשעבר</em> CAM Assay: איך זה באמת עובד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter