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Biology

Pulcino Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM saggio: Come funziona veramente

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

Il pulcino corioallantoidea membrana (CAM) è un ambiente unico e naturalmente immunodeficienti cultura di sostegno allo studio dell'angiogenesi e tumorigenesi. In questo articolo video mostra le varie fasi pulcino

Abstract

Uova di gallina nella prima fase di allevamento sono tra dati in vitro e in vivo e sistemi di fornire un ambiente di test vascolare non solo per studiare l'angiogenesi, ma anche per studiare tumorigenesi. Dopo la membrana pulcino corioallantoidea (CAM) ha sviluppato, la sua rete di vasi sanguigni possono essere facilmente accessibili, manipolato e osservato e quindi fornisce un ambiente ottimale per le analisi angiogenesi. Dato che il sistema linfatico non è completamente sviluppato fino ultime fasi di incubazione, l'embrione di pollo serve come ospiti naturali immunodeficienti in grado di sostenere i tessuti e le cellule senza innestato specie-specifiche restrizioni. Oltre a coltivare lo sviluppo di allo-e xenotrapianti, la rete di vasi sanguigni CAM offre un ambiente unico e di sostegno per intravasation delle cellule tumorali, la diffusione e l'arresto vascolare e un archivio in cui le cellule arrestato stravaso di formare micro foci metastatici.

A fini sperimentali, nella maggior parte degli studi recenti la CAM è stata esposta dal taglio di una finestra attraverso il guscio dell'uovo e gli esperimenti sono stati condotti in ovo, con conseguente limitazione significativa l'accessibilità del CAM e le possibilità di osservazione e documentazione fotografica degli effetti. Quando la shell-less culture del embrione di pollo sono stati usati 1-4, nessun dettaglio sperimentale sono state fornite e, se pubblicate in tutti, i tassi di sopravvivenza di queste culture erano basse. Abbiamo raffinato il metodo della cultura ex ovo di embrioni di pollo in modo significativo, introducendo un estrusione razionalmente controllata del contenuto dell'uovo. Queste culture ex ovo migliorare l'accessibilità dell'embrione CAM e pulcino, consentendo un facile nella documentazione in vivo degli effetti e facilitare la manipolazione sperimentale dell'embrione. Questo consente l'applicazione di successo a un gran numero di questioni scientifiche: (1) Come un saggio angiogenesi migliorato 5,6, (2) un set up sperimentale per preparazioni iniettabili facilitato nel vitreo dell'occhio embrione di pollo 7-9, (3) come ambiente di test per la diffusione e intravasation di dispersi cellule tumorali da linee cellulari stabilizzate inoculati sul CAM 10-12, (4), un sistema migliore per sostenere il trapianto di successo e la cultura delle gemme degli arti di pollo e topi 13 come pure (5 ) per l'innesto, propagazione, e ri-innesto di solido tessuto tumorale primaria ottenute da biopsie sulla superficie del CAM 14.

In questo articolo video che descrivono la creazione di una cultura raffinata ex pulcino ovo e test CAM con tassi di sopravvivenza oltre il 50%. Oltre che fornire una dimostrazione passo passo per l'applicazione di successo della cultura ex ovo per un gran numero di applicazioni scientifiche.


Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, e Sebastian Gustmann contribuito in maniera uguale a questo studio.

Protocol

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Tutte le attrezzature ei reagenti devono essere acquistati sterile o ha bisogno di essere calore o vapore, sterilizzati o sterilizzati con il 70% ETOH.

Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l'uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l'Università di Duisburg-Essen (Germania).

Parte 1: incubazione di uova

  1. Uova fecondate possono essere conservati a 13 ° C per un massimo di una settimana.
  2. Le uova vengono incubate per 72 ore, in posizione orizzontale in un incubatore con un vassoio in movimento, ruotando le uova 12 volte al giorno in continuo. L'umidità è mantenuto a 60 - 62%, temperatura di incubazione a 37,5 ° C.
    Nota: Prima di iniziare l'incubazione, la sporcizia, piume ed escrementi sono accuratamente rimosso dai gusci d'uovo meccanicamente da un'asciugatura con comuni, asciugamani in carta grigia a zig-zag, che hanno una ruvida piuttosto che una struttura di superficie morbida. Pulendo le uova con etanolo o disinfettante, tuttavia, ha ridotto significativamente il tasso di sopravvivenza degli embrioni, indipendentemente dal liquido utilizzato.

Parte 2: Ex cultura ovo

  1. Dopo incubazione per 72 ore, le uova vengono rimossi dal termostato.
    Nota: Le uova sono incubate per 72 ore perché - secondo i nostri esperimenti - per motivi sconosciuti, ma in accordo con Auerbach et fasi di sviluppo al.1 prima avevano tassi di sopravvivenza significativamente più bassi. Nelle fasi successive di 72 ore il sacco vitellino non ancora coperti dalla CAM diventa più sottile e tende ad aderire al guscio dell'uovo leader (i) a piccole emorragie nella zona di aderenza e (ii) la rottura del tuorlo, sacco membrana. Pertanto, il metodo presentato non è applicabile agli embrioni più di 72 ore.
  2. La parte superiore delle uova, dove risiede l'embrione, è segnato dalla matita perché l'embrione resiste rotazione in una certa misura.
  3. L'uovo è tenuto in orizzontale con il segno a matita sulla parte superiore e screpolata ai margini di un bar 80 triangolare mescolare millimetri magnetica perpendicolare che orientato lungo l'asse dell'uovo.
    Nota: per un feeling migliore, senza guanti devono essere utilizzati, ma le mani devono essere disinfettati con il 70% EtOH. E 'importante che il guscio d'uovo così come la membrana dell'uovo si aprono. Perdite di albume d'uovo è un segno sicuro che la membrana dell'uovo è stata perforata.
  4. L'uovo è mantenuto vicino al fondo della scatola di Petri per evitare perdite maggiori di albume.
    Nota: durante la procedura di apertura iniziale, è importante che il bianco d'uovo sul fondo della scatola di Petri è ancora collegato al resto dentro l'uovo come questo si traduce in un vuoto dentro l'uovo che contiene il tuorlo con l'embrione in alto all'interno l'uovo. Il vuoto può essere regolata sia per la pressione delle dita che controlla l'ingresso di aria nel uovo o sollevando l'uovo che aumenta la colonna collegati albume cioè il vuoto.
  5. Delicatamente applicando una pressione al meridiano che passa attraverso la fessura e l'equatore l'uovo con il pollice e il medio, è possibile regolare il vuoto. Il contenuto dell'uovo possono poi essere trasferiti al Petri danneggiato, se l'uovo con il tuorlo viene delicatamente sollevato e le due metà della conchiglia sono accuratamente separati. L'embrione e il tuorlo vasi dovrebbe trovarsi in cima ad un tuorlo integro.
    Nota: se il segno di matita non viene tenuto in alto, l'embrione potrebbe essere male quando rottura del guscio. Se le uova non sono incrinate con sufficiente attenzione o gli embrioni sono più vecchi di 72 ore (vedi sopra), il sacco vitellino si attacca al guscio e spesso rotture. Lo stesso accade quando l'umidità del incubatore è inferiore al 60% o le uova non vengono ruotate durante l'incubazione.
  6. Ex ovo culture vengono restituiti in un incubatore e mantenuto a 37,5 ° 38,2 ° C e umidità 60%. CO 2 o O 2 alimentazione non è necessaria se l'incubatore non è chiuso ermeticamente (griglia di ventilazione parzialmente aperta!) E speciali piastre di Petri con distanziali tra coperchio e piatto vengono utilizzati.
    Nota: Lo spostamento degli embrioni dovrebbe essere ridotto al minimo durante i primi giorni di incubazione. Risultati agitazione troppo elevati tassi di mortalità. Da incubazione giorno 9 in poi, gli embrioni sono meno sensibili alla agitazione.
    Embrioni morti devono essere rimossi immediatamente per evitare infezioni.
    Se incubatori per colture cellulari vengono utilizzati, che sono ermeticamente chiusi, O 2 l'offerta è obbligatoria per gli embrioni non morire. L'umidità è essenziale per la CAM non si secchi e se la temperatura di incubazione è inferiore a 37 ° C, gli embrioni si sviluppano troppo lentamente.

Parte 3: Applicazione di sostanze per saggi angiogenesi

  1. Autoclavato fogli piegati filtro (50,5 millimetri di diametro) vengono perforate da una perforatrice e utilizzato come materiale di supporto (carrier) per sostanze liquide applicate al CAM.
    Nota: Quasi ogni materiale di supporto (vedi tabella sotto) ha causato l'irritazione del CAM, soprattutto se applicata prima del giorno di incubazione 10, come ha cambiato la sviluppo dell'architettura nave CAM. Ciò riguarda anche le sostanze potenzialmente inerti come la pellicola di cellulosa idrossietil, spugne Teflon (PTFE-tamponi), spugne di collagene, foglio di collagene, garze sterili (tamponi), copri-rotondo, e anelli di silicio, che ha causato tutti i risultati falsi positivi. Carta da filtro sembrava provocare il minor irritazione ed è stata quindi utilizzata nei nostri test.
  2. Quando la CAM è pienamente sviluppato, fino a 6 diversi campioni possono essere applicati e dei loro effetti possono essere confrontati su un singolo CAM.
  3. Per evitare l'essiccamento dosi filtri aggiuntivi (3 mcg angiotropin nativo) o buffer (5 microlitri PBS) deve essere nuovamente applicata ogni giorno.
  4. Dal 3 ° giorno dopo l'applicazione, i vasi sanguigni orientare verso le sostanze angiogenico sui filtri, mentre il modello dei vasi sanguigni circostanti controlli è invariato.
    Nota: La CAM non deve essere confuso con il tuorlo-sacco. Il CAM è una struttura dinamica di sviluppo, mentre il sacco vitellino è statico, con variazioni poco durante lo sviluppo. Il giorno di sviluppare tre il CAM di sviluppo possono essere riconosciuti per la prima volta alla fine caudale dell'embrione come una piccola vescicola. Tra tre giorni e dieci giorni di vescicola iniziale si espande, creando una piegato due strati di membrana overgrowing il sacco vitellino ad un tasso crescente. Il sito di applicazione dovrebbe essere a metà strada tra embrione e la piega del CAM (confine) altrimenti l'embrione ostacola l'osservazione microscopica di effetti in luce trasmessa. In alternativa, il filtro con la sostanza angiogenico è interiorizzato quando la CAM continua a crescere.

Parte 4: inoculazione di cellule sul CAM

4.1.Preparation di cellule

  1. Cellule confluenti vengono trasferiti dal fiasco cultura ai tubi FALCON con l'uso di una pipetta sterile 25 ml in plastica con una pipetta di aiuto.
  2. Per stimare il numero di cellulare, 15 ml di sospensione cellulare viene trasferito in una camera di Neubauer e le cellule vengono conteggiati manualmente al microscopio.
  3. Falcon tubi vengono centrifugati per 3 min a 1000 rpm a temperatura ambiente e il supernatante viene scartato.
  4. Per il monitoraggio delle cellule vive, le cellule sono diluiti con PBS alla concentrazione desiderata (qui: 2x10 7 cellule / ml) e colorati con ad esempio PKH26 (Sigma), un rosso fluorescente vivere membrana cellulare kit etichettatura, secondo i produttori 'protocollo.
    Le cellule sono risospese in terreno di coltura cellulare (preferibilmente medio Dulbecco modificato aquila; DMEM) alla concentrazione desiderata per l'iniezione (10 7 cellule / ml) o inoculazione (3x10 6 cellule / ml). Le concentrazioni di cellule differenti sono applicati per le iniezioni contro l'inoculazione in base alle concentrazioni già pubblicati in letteratura 15-17 e la nostra esperienza.

4,2 inoculazione di cellule sul CAM

  1. Anelli (~ spessore 1mm) sono tagliati da un puntale da 1 ml o un catetere venoso periferico (PVL) Tubo con l'uso di un bisturi tagliente e applicato al CAM di un E6-E14 pulcino ex ovo embrione in coltura.
    Nota: Cerca di non "visto" più volte, ma per tagliare la punta della pipetta o catetere con un taglio con un bisturi nuovo, molto forte per evitare spigoli vivi sugli anelli risultante. Controllare gli anelli sotto il microscopio di spigoli vivi che derivi dalla micro-fessure.
  2. A seconda delle dimensioni degli anelli 20 l di 3x10 6 cellule / ml cellule sono pipettati in totale in un anello o come volumi divisi in anelli multipli.
    Nota: In alcuni casi traumatizzazione del CAM raschiando dolce è un pre-requisito, ad esempio, per facilitare l'inoculazione di cellule 17 e capillarizzazione degli innesti (vedi sotto). Se, invece, traumi della CAM non è destinato o contraindicative, ad esempio per lo studio del potenziale invasivo delle cellule tumorali, gli anelli non devono essere utilizzati per l'inoculazione, ma le cellule devono essere applicati direttamente come applicazione di anelli o anelli stessi potrebbe indurre lesioni micro . Se gli anelli sono utilizzati, questi devono essere tagliate il più sottile possibile per minimizzare il peso ed evitare il rientro del CAM.

Parte 5: iniezione intravitreale di cellule

  1. Una siringa Hamilton microlitri è risciacquato più volte con EtOH 70% e infine con PBS sterile.
  2. La siringa micro è riempito con la sospensione preparata cellula colorata o senza macchia (cfr. parte 4.1).
    Nota: il sito di iniezione deve essere scelto con cura, per non danneggiare i vasi sanguigni delle strutture CAM o adiacente dell'embrione (brain!) da più di penetrazione con l'ago. L'iniezione deve essere fatta sotto un binocolo dissezione.
  3. Sotto il controllo microscopio, Con attenzione, ma rapidamente penetrare il CAM e strati occhio con l'ago della siringa e iniettare continuamente da 10 a massimo 20 microlitri sospensione cellulare (preferibilmente diluito in PBS) nel vitreo dei ovo embrione ex pulcino colta.
    Nota: se la CAM non può essere penetrato con l'ago, potrebbe essere rimossa in un sito con i vasi sanguigni poche o nessuna con delicatezza lacerando con due pinze.
  4. L'ago deve rimanere 1-2 secondi in un occhio per evitare una perdita di sospensione cellulare iniettato da perdite.

Parte 6: dissezione di gemme degli arti pollo

  1. Le uova sono ritirate dall 'incubatrice dopo 3 o 4 giorni di incubazione (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
  2. Le uova sono rotto sul bordo di una barra triangolare ancoretta magnetica e trasferiti in una piastra di Petri (dettagli: si veda Parte 2) e l'embrione viene sezionato dai vasi tuorlo collegati da taglio un cerchio con le forbici a molla.
  3. L'embrione viene trasferito in un piatto fresco Petri riempite con il freddo, sterile PBS con l'uso di un cucchiaio di scarico piccola e bagnata dal agitazione genere.
  4. L'embrione viene trasferito in una piccola scatola di Petri riempite con PBS sterile e liberati dalle membrane circostanti, accuratamente lacerando con una pinza sottile.
  5. Gemme degli arti si staccano da pinze microchirurgica più vicino al corpo il più possibile, colto e trasferito al CAM di un 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto).

Parte 7: Preparazione di gemme degli arti del mouse

  1. Accoppiamenti tempo in stato di gravidanza sono istituiti e la mattina del giorno in cui viene rilevato un plug vaginale in accoppiamento le femmine è designato 0 gestazione giorno.
  2. La femmina gravida, è stato immolato per dislocazione cervicale quando lo sviluppo degli embrioni raggiunto giorni embrionale (E) 10 a 13 e fissato su un bordo di cera.
  3. La parete addominale è inumidito con il 70% ETOH, tagliare lungo la linea mediana e la lembi cutanei vengono fissati lateralmente da perni.
  4. Entrambe le corna dell'utero vengono rimossi con l'addome, distaccato e trasferito in un bicchiere con PBS freddo.
  5. Gli embrioni sono separati, trasferito in una piastra di Petri e la parete dell'utero e delle membrane embrionali vengono rimossi con attenzione con l'uso di forcipe.
  6. Gemme degli arti vengono tagliati con l'uso di forbici primavera o distaccato da una pinza sottile più vicino al corpo il più possibile, colto e trasferito al CAM di 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto).

Parte 8: Raccolta dei campioni di tumore

  1. Biopsie del tumore sono raccolti in provette Eppendorf da 2 ml riempito con cellule tumorali specifici per mezzo di coltura (qui: media Leibovitz) e conservato a temperatura ambiente.
  2. Biopsie del tumore sono tagliati in pezzi da 1-2 mm3 bisturi sterile.
    Nota: Se i campioni tumorali erano troppo piccoli, potrebbero non allegare alla CAM, se fossero troppo grandi, la CAM potrebbe essere ferito e l'embrione potrebbe morire.
  3. Un pezzo dal nucleo del campione bioptico si innesta il CAM di 8-10-giorno-vecchio ospitare ex ovo di pollo in coltura (vedi procedura di trapianto).
    Nota: Prendendo materiale dalla superficie della biopsia aumenta il rischio di contaminazione con il muscolo o del tessuto connettivo.

Parte 9: procedura di trapianto

  1. Per l'innesto di gemme arto o campioni di tumore, il pieno sviluppo della CAM 8-10-giorno-vecchi embrioni di pollo in coltura ex ovo viene utilizzato.
  2. Gli innesti sono nella posizione ideale sulla CAM Y vicino ad una biforcazione di un vaso sanguigno.
  3. Presso il sito di applicazione desiderata, la CAM è selettivamente traumatizzato da fuori raschiatura dolce (forcipe) la parte superiore peridermal del doppio strato epiteliale, lasciando intatto lo strato basale.
    Nota: è essenziale per evitare sanguinamenti o rottura di capillari visibili.
  4. L'innesto è trasferito al CAM con il minimo PBS allegato. A seconda del trapianto, potrebbe essere inserito una o due volte su un sito del CAM, dove non è previsto alcun innesto finale di rimuovere eccessive PBS e poi finalmente innestato nel sito preparato CAM traumatizzati.
  5. L'innesto viene afferrata da una pinza sottile e stratificato sul CAM. A seconda della sensibilità del trapianto, una leggera pressione potrebbe essere applicata (non adatto per gemme degli arti) per manovrare l'innesto in una rientranza risultante del CAM (adatto per campioni di tumore).
    Nota: Poiché il sistema immunitario sviluppa pulcino al giorno embrionale (E) 18, ex ovo xenotrapianti culture non deve essere prolungato al di là E17 come gli embrioni ospitare pulcino spesso muoiono.
    E 'importante avere a disposizione CAM ospitare, rispettivamente ex ovo embrioni di pollo in coltura, in coincidenza con una fonte di tessuti del donatore di vostra scelta.

Parte 10: Re-trapianto

  1. L'embrione di pollo host viene ucciso per decapitazione.
  2. Il CAM conl'innesto allegato viene rimosso mediante un taglio circolare con le forbici a punta e trasferito in una piastra di Petri riempita con PBS.
  3. CAM eccessivo è tagliato dal trapianto di forbici a molla, tranne per il sito ex allegato.
  4. In caso di campioni tumorali più grande, l'innesto viene tagliato a metà o più pezzi più piccoli e ri-innestati con il tagliente rivolto verso il CAM nuovo del secondo host.

Parte 11: Risultati Rappresentante

Figura 1
Figura 1. Shell-meno pollo cultura
Embrioni di pollo di diverse fasi di sviluppo ex ovo colto in piastre di Petri.

Figura 2
Figura 2. Ex ovo saggio dell'angiogenesi CAM
Uova di gallina fecondate sono state incubate in orizzontale a 37 ° C e umidità del 60 - 62% e screpolata in piastre di Petri al giorno embrionale 4 (E4). L'incubazione è proseguita nelle stesse condizioni. A E10 carte filtro sterile (5,5 mm di diametro) sono state stratificate sulla parte superiore del CAM e imbevuto sia con 5 microlitri PBS o 3 mg nativo angiotropin6. Capillari ha mostrato evidenti allineamento verso la carta imbevuta angiotropin filtro E14.

Figura 3
Figura 3. Ovo Ex innesti di gemme degli arti
Gemme degli arti da pulcino (E3/E4) e mouse (E13) sono stati innestati i CAM del guscio inferiore culture pollo. I vasi sanguigni dal CAM inseriti i germogli arto dopo due giorni. Lo sviluppo delle gemme degli arti continuato in queste culture ex ovo raggiungendo una falange in due fasi pulcino e la visualizzazione di riduzione delle reti interdigitali in gemme degli arti murini.

Figura 4
Figura 4. Ex ovo inoculazione del campione di tumore
Un campione bioptico di carcinoma della vescica è stato inoculato sul CAM di un 10-pulcino ex ovo embrione in coltura. Dopo due giorni di cultura, il campione del tumore è stato collegato al sistema vascolare CAM e dopo 7 giorni, i vasi sanguigni più entrare nel trapianto sono stati osservati.

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Discussion

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Innovativi o solo un altro protocollo cultura pulcino?

Con l'ex-shell meno protocolli di cultura 1-4 il tasso di sopravvivenza totale degli embrioni pulcino erano basse, ad esempio ca. 30% 1. Il raffinato protocollo cultura ex ovo descritto in questo articolo video, al contrario, permette di tassi di sopravvivenza oltre il 50%. Rispetto al classico nelle culture cultura ex ovo ovo di embrioni di pollo facilita in modo significativo l'accessibilità di un embrione CAM e pulcino e permette la loro manipolazione sperimentale e monitoraggio continuo. Questo metodo di coltura può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni che vanno dai saggi di angiogenesi maggiore 5,6, alle iniezioni facilitato nel vitreo dell'occhio embrione di pollo 7-9, saggi intravasation 10-12, migliorato l'innesto e la crescita di gemme degli arti 13 e la manutenzione innovativa di campioni tumorali 14. Così, ex ovo cultura contribuisce un utile strumento per lo sviluppo, angionesis e tumore della ricerca.

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Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare J. Kueper e J. Wittschier per un'eccellente assistenza tecnica e il Prof. Ruebben generosamente per la fornitura di materiale tumorale.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Pulcino<em> Ex ovo</em> Cultura e<em> Ex ovo</em> CAM saggio: Come funziona veramente
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Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

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