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Biology

チック EX卵文化と EX卵 CAMアッセイ:それが実際にどのように動く

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

ニワトリ漿尿膜(CAM)は、血管新生と腫瘍形成を研究するユニークな、自然に免疫不全支える文化環境です。このビデオの記事では、ニワトリの異なるステップを示しています

Abstract

繁殖の初期段階での鶏の卵は、in vitroおよび in vivo の間にあると血管新生を研究するだけでなく、腫瘍形成を研究するだけでなく、血管のテスト環境を提供しています。ニワトリ漿尿膜(CAM)が開発された後、その血管のネットワークを簡単に、アクセス操作や観察、したがって、血管新生アッセイの最適な設定を提供することができます。リンパ系が完全にインキュベーションの後期段階まで開発されていないので、ニワトリ胚では、種特異的制限なしに移植された組織や細胞を維持できる自然に免疫不全宿主の役割を果たします。同種および異種移植の開発育成に加えて、CAMの血管のネットワークは、腫瘍細胞の脈管内へ、普及、および血管の逮捕と逮捕の細胞はミクロ転移巣を形成するために浸出リポジトリの一意な環境を提供します。

実験的な目的のために、CAMが卵の殻と実験により、ウィンドウを切断することによって露出された最近の研究のほとんどに効果の観察と写真ドキュメンテーションのためのCAMとの可能性のアクセシビリティの重要な制限の結果、OVOで実施された。ニワトリ胚の殻のない文化が1-4を使用した場合に、実験的な詳細はまったく公開されている場合は、提供されないとされ、これらの培養物の生存率は低かった。私たちは、卵のコンテンツの合理的制御押し出しを導入することにより、大幅にニワトリ胚の元OVO文化の方法を精緻化。これらの元OVOの文化は、効果のin vivoでのドキュメント簡単に有効化および胚の実験的操作を容易に、CAMおよびニワトリ胚のアクセシビリティを向上させる。ニワトリ胚の眼7-9の硝子体に容易に注射のために設定(1)改良された血管新生アッセイ5,6として、(2)実験、(3):これは、科学的な質問の多数に成功したアプリケーションを可能に成功した移植と文化鶏肉やマウス13の肢芽のほか、(5のための改善、持続性のあるシステムとしてCAM 10-12接種樹立した細胞株から分散した腫瘍細胞、(4)の普及と管内のためのテスト環境として)、伝播を移植し、カム14の表面上に生検から得られた固形原発腫瘍組織の再移植のための。

このビデオの記事では、洗練されたひよこの元OVO文化と50%以上の生存率とCAMアッセイの確立について説明します。加えて我々は科学的な多数のアプリケーションのための元OVO文化の成功したアプリケーションのステップのデモンストレーションで手順を提供します。


ダニエルS. Dohle、スザンヌD.パシャ、とセバスチャンGustmannはこの研究にも同様に貢献した。

Protocol

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すべての機器および試薬は、滅菌購入する必要がありますまたは熱または蒸気滅菌または70%エタノールで滅菌する必要があります。

動物実験は動物実験で定められている実験的な手続きと規制のための動物の管理と使用に関するNI​​Hのガイドラインに従って、欧州共同体理事会指令(86/609/EEC)に準拠して行われたという著者らの状態ケアとデュースブルク - エッセン大学(ドイツ)での委員会(IACUC)を使用してください。

パート1:卵のインキュベーション

  1. 受精卵は、最大1週間までに13℃で保存することができます。
  2. 卵は12回日連続して卵を回転させ、移動トレイ付きインキュベーターで水平に横たわって、72時間インキュベートする。湿度は60に保たれている - 62%、37.5でのインキュベーション℃の温度
    注:インキュベーション、汚れ、羽や糞を開始する前に慎重にではなく、ソフト面の構造よりもラフを持っている共通の、灰色のジグザグのハンドペーパータオル、と乾いたワイピングによって機械的に卵の殻から削除されています。エタノールまたは消毒剤で卵を拭く、しかし、大幅に関係なく使用される液体の、胚の生存率を減少させた。

パート2: 例OVO文化

  1. 72時間のインキュベーション後、卵はインキュベーターから削除されます。
    :ための卵を72時間インキュベートされている-未知の理由のためですがアウエルバッハら1以前の開発段階と一致して有意に低い生存率を持っていた-私たちの実験によると。後72時間以上の段階ではまだCAMによってカバーされていない卵黄の袋は薄くなり、小さな遵守の領域における出血と卵黄袋の(ⅱ)破裂する(i)世界の主要卵の殻に付着する傾向が膜。したがって、提示方法は、72時間以上経過した胚には適用されません。
  2. 胚は、ある程度回転に抵抗するので、胚が存在する卵の上面が、、鉛筆でマークされます。
  3. 卵は上に鉛筆のマークで水平に保持し、卵の長軸に垂直に配向を敷設80ミリメートル三角マグネチックスターラーバーの端に割れている。
    :より良い感じでは、ない手袋を使用してはいけませんが、手は70%エタノールで消毒してください。卵の殻だけでなく、卵膜が開放されていることが重要です。卵白の漏出は、卵膜が穿孔されていることを安全なサインです。
  4. 卵は卵白のさらなる漏れを避けるために、近くにペトリ皿の底部に保持されます。
    注:初期のオープニングの手順の間に、ペトリ皿の底に卵白がまだ上部内側胚と卵黄を保持している卵の内側に真空中でこの結果として卵の内側部分に接続されていることが重要です。卵。真空は、どちらの卵への空気の流入を制御する指の圧力によって、または接続された卵白すなわち真空の列を増加させる卵を持ち上げることによって調節することができる。
  5. 優しく親指と中指で卵の亀裂と赤道を通過する子午線に圧力を加えることによって、それは真空を安定化させることが可能です。卵黄と卵を静かに持ち上げているとシェルの両半分が慎重に区切られている場合は、卵の内容は、その後、無傷のペトリ皿に転送することができます。胚と卵黄の船が無傷の卵黄の上に横にしてください。
    :鉛筆のマークが上に保持されていない場合、シェルをクラッキングするときに、胚を傷つける可能性がある。卵は慎重に十分なひび割れや胚が(上記参照)72時間以上経過していない場合は、卵黄の袋には、シェルとしばしば破裂するスティック。インキュベーターの湿度が低く60%以上または卵が孵化時に回転していないときも同様です。
  6. EX卵培養はインキュベーターに戻し、37.5 ° 38.2 ° Cと60%の湿度で保管されています。インキュベーターが密閉されていない(換気のグリッド部分的にオープン!)と蓋と皿の間にスペーサーを持つ特殊ペトリ皿を使用する場合、CO 2やO 2の供給は必要ありません。
    :胚の移動は、インキュベーションの最初の日の間に最小限に抑える必要があります。高い死亡率にあまりにも多くの扇動の結果。インキュベーションの9日目以降は、胚は、攪拌の影響を受けにくくなります。
    死亡胚は感染症を避けるために直ちに削除する必要があります。
    細胞培養インキュベーターが使用されている場合は、密閉されている、O 2の供給が死ぬことではない胚のための必須です。 CAMが乾燥しないようにし、培養温度が37℃よりも低い場合、胚があまりにもゆっくりと進行するだろう。ために湿度が不可欠です。

パート3:血管新生アッセイのための物質の応用

  1. オートクレーブ折り畳んだろ紙(5直径0.5ミリメートルの)穴パンチャーで打ち抜き、CAMに適用される液体物質の材料(キャリア)をサポートとして使用されます。
    :それは発展途上CAM容器のアーキテクチャを変更したとして、ほぼ各担体材料は、(下記の表を参照)、培養10日目の前に適用される場合は特に、CAMの炎症を引き起こした。これはまた、潜在的に不活性なヒドロキシエチルセルロース箔のような物質が、テフロンのスポンジ(PTFE - pledgets)、コラーゲンスポンジ、コラーゲン箔、滅菌ガーゼ(綿棒)、すべての偽陽性の結果を引き起こした円形カバースリップ、およびシリコンのリングを、含まれています。ろ紙には、少なくとも刺激を引き起こすように見えたことで、我々のアッセイで使用されていました。
  2. CAMが完全に開発されている場合、最大6つの異なるサンプルを適用してもよいし、その効果は、単一のCAMで比較することができます。
  3. フィルタ追加投与(3μgのネイティブangiotropin)またはバッファ(5μlのPBS)、乾燥を避けるために、毎日再適用する必要があります。
  4. コントロールを周囲の血管のパターンが変更されていないのに対し、塗布後3日目から、血管は、フィルター上で血管新生物質に向けてオリエンテーション。
    注:CAMは卵黄袋と間違えてはいけません。卵黄の袋は、開発時に少し分散を持つ静的でありながら、CAMは、動的な発展構造です。開発3日目の開発CAMは小胞と胚の尾方端で初めて認識することができる。 3日目一日10までの初期の小胞は、増加率で卵黄の袋をover​​growing折り畳まれた2層の膜を作成し、拡張します。アプリケーションのサイトでは、特に胚の透過光の効果の顕微鏡観察を妨げるような胚およびCAM(ボーダー)の倍の間に半分の方法でなければなりません。 CAMが増え続けて時あるいは、血管新生物質とフィルタが内在化されています。

第4部:CAMへの細胞への接種

細胞の4.1.Preparation

  1. コンフルエントの細胞をピペットエイドを使用して滅菌25mlのプラスチックのピペットを使用することにより培養フラスコからファルコンチューブに移しています。
  2. 細胞数を推定するために、細胞懸濁液の15μlをノイバウアー室に搬送され、細胞を顕微鏡下で手動でカウントされます。
  3. ファルコンチューブは、室温で1000rpmで3分間遠心分離し、上清は廃棄されます。
  4. メーカーのプロトコルに従って、および赤色蛍光生細胞の膜の標識キット、例えば、PKH26(Sigma社)で染色した:生細胞の追跡のために、細胞は、所望の濃度(2 × 10 7細胞/ mlここ)にPBSで希釈されています。
    希望の注入のための濃度(10 7細胞/ ml)または接種(3 × 10 6セル/ ml)に、細胞は、細胞培養培地(DMEM優先的にダルベッコ改変イーグル培地)に再懸濁している。異なる細胞濃度は、すでに文献15から17と我々の経験に掲載された濃度に応じて注射対接種のために適用されます。

CAM上のセル4.2接種

  1. 指輪(〜1mm厚)が鋭いメスを使用して1ミリリットルピペットチップまたは末梢静脈カテーテル(PVL)チューブから切断し、E6 - E14ニワトリ胚培養元のOVOのCAMに適用されます。
    :いくつかの回を"見た"ことではなく、ワンカットが生じるのリング上でシャープなエッジを避けるために、新しい、非常に鋭いメスを用いてピペットチップまたはカテーテルの管を通って切断しないようにしようマイクロクラックに起因する鋭いエッジのための顕微鏡の下のリングを確認してください。
  2. リングのサイズによっては3 × 10 6細胞/ mlの細胞20μlを一つの環にまたは複数のリングに分割ボリュームなど、合計でピペッティングしている。
    :場合によっては、穏やかなスクレイピングによるCAMのtraumatisationはセル17と移植片のcapillarisation(下記参照)の接種を促進するための前提条件、などです。しかし、CAMのtraumatisationが意図されていないか、または腫瘍細胞の浸潤能の研究のためなど、contraindicative、リングは接種のために使用すべきではないが、細胞がリングやリングの応用として直接適用されるかどうか自体がマイクロ病変を誘発するかもしれない。リングが使用されている場合、これらは重量を最小限に抑え、CAMのインデントを避けるために、できるだけ薄くカットしてください。

パート5:細胞の硝子体内注射

  1. ハミルトンマイクロリットルの注射器は滅菌PBSで最終的に70%エタノールとで数回リンスする。
  2. マイクロシリンジは、準備ステンドグラスや染色細胞懸濁液(パート4.1を参照)が充填されている。
    注:注射部位を慎重に選ぶ必要がある、針で貫通以上で胚のCAMまたは隣接する構造物(brain!)の血管を傷つけるためではない。注入は、解剖の双眼で行う必要があります。
  3. 顕微鏡の制御下、慎重に、しかし、すぐに注射針でCAMと目の層に浸透し、継続的にニワトリ胚培養元のOVOの硝子体に最大20μlの細胞懸濁液(優先的にPBSで希釈)に10を注入。
    注:CAMを針で貫通することができない場合、それは静かにtwoピンセットでそれを離れて引き裂くことによりほとんどまたはまったく血管のあるサイトで削除されることがある。
  4. 針は、漏れによって注入された細胞懸濁液の損失を避けるために、目の中に1〜2秒のままです。

パート6:ニワトリの肢芽の解剖

  1. 卵はインキュベーターから削除されますインキュベーションの3〜4日後(E3/E4 =ハンバーガーハミルトン(HH)stage18 - 23)
  2. 卵は、三角形のマグネチックスターラーバーの端にひび割れやペトリ皿に移し、(詳細:パート2を参照)され、胚は、春のはさみを使って円をカットして接続されている卵黄の船から解剖される。
  3. 胚は小さなドレインスプーンの使用によって冷たい、滅菌PBSで満たされた新鮮なペトリ皿に移し、親切な攪拌によって洗浄される。
  4. 胚は、慎重に微細な鉗子でそれらを離れて引き裂く、滅菌PBSを充填し、周囲の膜から解放される小さなペトリ皿に移している。
  5. 肢芽は、(移植の手順を参照してください)把握し、8、10日齢のホストニワトリ培養元のOVOのCAMに転送、なるべく身体の近くに顕微鉗子で切断されます。

パート7:マウス肢芽の準備

  1. 時間妊娠交配が設定され、膣栓が女性の交配で検出される日の朝は、妊娠0日を指定されます。
  2. 妊娠中の女性は、胚の発達は、(E)10 13に日胚に到達し、ワックスのボード上に固定されて頸椎脱臼により屠殺された。
  3. 腹壁を正中線に沿って切断し、皮膚フラップはピンで横方向に固定され、70%エタノールで湿らされています。
  4. 子宮の両方の角をデタッチし、冷PBSでビーカーに移し、腹部から削除されます。
  5. 胚を分離し、ペトリ皿と子宮の壁に転送し、胚膜は鉗子を使用して慎重に除去されています。
  6. 肢芽は、把握し、8、10日齢のホストニワトリ培養元のOVO(移植の手順を参照)のCAMに転送、春のはさみを使用することによって切断、あるいはできるだけ身体に近づけて細かい鉗子によって切り離されている。

パート8:腫瘍サンプルの収集

  1. 腫瘍生検は、腫瘍細胞特異的培地(ここで:リーボビッツの培地)を充填した2ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに回収され、室温で保存。
  2. 腫瘍生検は無菌のメスで1〜2立方ミリメートル片に切断されています。
    :腫瘍のサンプルが小さすぎていた場合、彼らはあまりにも大きかった場合、彼らは、CAMに接続されない場合があります、CAMが負傷する可能性があり、胚が死ぬかもしれない。
  3. 生検標本のコアからの作品は、8、10日齢のホストニワトリ培養元のOVO(移植の手順を参照)のCAMに移植されています。
    :生検の表面から材料を取ることは筋肉や結合組織による汚染のリスクを増大させる。

パート9:グラフト手順

  1. 肢芽や腫瘍試料のグラフトでは、8、10日齢のニワトリ胚の完全に開発されたCAM培養元のOVOが使用されます。
  2. 移植片は、理想的に血管のY分岐近くCAM上に配置されています。
  3. 目的のアプリケーションのサイトでは、CAMが選択的に基底層はそのまま残し、穏やかなスクレイピングのオフ(鉗子)二上皮層の上側の周皮の一部が傷つけている。
    :これは、出血や毛細血管の可視破裂を避けるために不可欠です。
  4. 移植片は、接続されている最小限のPBSでCAMに転送されます。移植に応じて、それは移植は最後のが過度のPBSを除去することを意図しないし、最後に準備トラウマCAMサイトでグラフトさCAM、のサイトに一度か二度配置される場合があります。
  5. 移植片は、微細な鉗子で把持し、CAM上に重層されています。移植片の感度に応じて、光の圧力は、CAM(腫瘍サンプルに適しています)の結果インデントに操作する(肢芽に適していません )移植片に適用される場合があります。
    :ひよこ免疫システムは、胎生(E)18で発展するにつれ、ホストのニワトリ胚は、頻繁に死ぬように、 元OVO異種移植片の培養物は、E17を超えて延長されるべきではない。
    それはあなたの選択のドナー組織のソースと一致するようにタイミングをそれぞれ利用可能なホストのCAMは、ニワトリ胚培養元のOVOを、持つことが重要です。

パート10:再移植

  1. ホストのニワトリ胚断頭により殺される。
  2. とCAM添付された移植片は、先の尖ったハサミを持つ円形の切断して除去し、PBSで満たしたペトリ皿に移している。
  3. 過度のCAMは、かつての付着部位を除いて春のはさみによって移植片からカットされます。
  4. 大きな腫瘍サンプルの場合には、移植片は半分またはいくつかの小さな断片に切断され、二番目のホストの新しいCAMが直面している最先端で再グラフト。

パート11:代表的な結果

図1
図1。シェルレスチキンの文化
異なる発展段階ペトリ皿で培養EX OVOのニワトリ胚。

図2
図2。 例OVO CAMの血管新生アッセイ
受精鶏卵を37で水平インキュベート60℃、湿度した - 62%、胚4日目(E4)でペトリ皿にひび。インキュベーションは、同じ条件で継続した。 E10滅菌濾紙(直径5.5 mm)でのCAMの上に階層化され、5μlのPBSまたはangiotropin6ネイティブ3μgのいずれかで浸漬。毛細血管は、E14でangiotropin浸したろ紙に向かって明らかなアライメントを示した。

図3
図3。肢芽の移植例OVOは、
ひよこ(E3/E4)およびマウス(E13)から肢芽は、シェルのない鶏の文化のCAMに移植した。 CAMからの血管は、2日後に肢芽に入った。肢芽の開発は、ニワトリ二つ指骨の段階に到達し、マウス肢芽におけるインターウェブの削減を表示するこれらの元OVOの文化に続いた。

図4
図4。腫瘍サンプルの例卵接種
膀胱癌の生検標本は、10日齢のニワトリ胚培養元のOVOのCAMに接種した。培養中の2日後、腫瘍検体はCAMの血管に接続され、7日後、移植片を入力する複数の血管が観察された。

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Discussion

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革新的なまたは単に別のひよこの文化のプロトコル?

旧シェルレス文化プロトコルでニワトリ胚1-4総生存率は、例えば約低かった。 30パーセント1。このビデオの記事で説明されている洗練された元OVO文化のプロトコルは、対照的に、50%以上の生存率が可能になります。ニワトリ胚の文化古典的な元OVO培養物と比較して大幅にCAMとニワトリ胚のアクセシビリティを容易にし、彼らの実験的操作と継続的な監視が可能になります。この培養法は、改善移植と肢芽の成長13、管内アッセイ10-12、ニワトリ胚の眼7-9の硝子体に容易に注射するために、拡張された血管新生アッセイから5,6に至るまで、アプリケーションのさまざまな使用することができます腫瘍サンプル14と革新的なメンテナンス。このように、 元OVO文化が発達、angionesisと腫瘍研究の有用なツールを貢献しています。

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Acknowledgments

著者は、寛大に腫瘍材料を供給するための優れた技術支援と教授RuebbenのためJ. KueperとJ. Wittschierに感謝します。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

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References

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チック<em> EX卵</em>文化と<em> EX卵</em> CAMアッセイ:それが実際にどのように動く
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Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

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