Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Civciv Ex ovo Kültür ve Ex ovo CAM Testi: Gerçekten Nasıl Çalışır?

doi: 10.3791/1620 Published: November 30, 2009

Summary

Civciv chorioallantoic membran (CAM), anjiyogenez ve tümörogenez çalışmak için eşsiz bir doğal bağışık yetmezliği olan, destekleyici bir kültür ortamı. Bu video makale piliç farklı adımları gösteriyor.

Abstract

Islah erken dönemde tavuk yumurtası, in vitro ve in vivo sistemleri arasında ve anjiyogenez okumak için değil, aynı zamanda tümörogenez çalışma sadece vasküler bir test ortamı sağlamak . Civciv chorioallantoic membran (CAM) sonra, kan damarı ağına kolayca erişilen manipüle ve gözlenen ve bu nedenle anjiyogenez deneyleri için uygun bir ortam sağlar. Lenfoid sistem tamamen inkübasyon geç evrelerine kadar gelişmemiş olduğundan, civciv embriyo türe özgü bir kısıtlama olmaksızın aşılı doku ve hücreler sürdürme yeteneğine doğal bağışık yetmezliği olan bir ev sahibi olarak hizmet vermektedir. Gelişmekte olan besleyici ek olarak allo ve xenografts, CAM kan damarı ağı, tümör hücresi intravasation, dağıtılması, ve damar tutuklandı hücrelerin mikro metastatik odaklar oluşturmak için extravasate tutuklanması ve bir depo için benzersiz bir destekleyici bir ortam sağlar.

Deneysel amaçlar için, son çalışmalar en CAM yumurta kabuğu ile bir pencere kesme ve deneyler, gözlem ve etkileri fotoğraf dokümantasyon imkanları CAM ve erişilebilirliğini önemli sınırlamalar, ovo yapılmıştır maruz kalmıştır . Civciv embriyo kabuk az kültürleri 1-4 kullanıldığı zaman, eğer yayınlanan hiçbir deneysel ayrıntıları, sağlanan ve bu kültürlerin sağkalım oranları oldukça düşüktür. Biz yumurta içeriğini bir rasyonel kontrollü ekstrüzyon tanıtarak civciv embriyo ex ovo kültürünün önemli yöntem rafine. Bu ex ovo kültürlerinin etkileri in vivo belgelerinde kolay sağlayan ve embriyo deneysel manipülasyon kolaylaştırılması, CAM ve civciv embriyo erişilebilirliğini artırmak. Bu bilimsel soruların çok sayıda başarılı uygulama sağlar: (1) tahlil 5,6 olarak geliştirilmiş bir anjiyogenez, (2) deneysel (3), 7-9 civciv embriyo göz vitreus kolaylaştırdı enjeksiyonlar için ayarlamak yaygınlaştırılması ve intravasation için bir test ortamı (5 CAM 10-12 inoküle kurulan hücre hatları tümör hücrelerinin, (4), tavuk ve fareler 13 de bacak tomurcukları başarılı transplantasyon ve kültürünün sürdürülmesi için geliştirilmiş bir sistem olarak dağınık olarak , aşılama, yayılımı, ve CAM (14) yüzeyinde biyopsilerinde elde edilen katı primer tümör dokusunun yeniden aşılama) .

Bu video makalede rafine civciv ex ovo kültür ve CAM sağkalım oranları% 50 üzerinde tahlil kurulması açıklanmaktadır. Ayrıca, çok sayıda bilimsel uygulamaları için ex ovo kültürünün başarılı bir uygulama adım gösteri bir adım sağlar .


Daniel S. Dohle, Susanne D. Paşa ve Sebastian Gustmann Bu çalışmada eşit katkıda bulunmuştur.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm ekipman ve reaktifler steril satın alınacak ya da ısı veya buharla sterilize veya% 70 ETOH ile sterilize edilmiş olması gerekir.

Hayvanlar üzerinde yapılan deneylerde, hayvanların bakımı ve kullanımı ile ilgili deneysel prosedürleri ve Kurumsal Hayvan tarafından belirlenen düzenlemelere NIH Rehberi ardından, Avrupa Toplulukları Konsey Direktifi (86/609/EEC) uygun olarak yapıldığını ve bu yazarlar Bakım ve Duisburg-Essen Üniversitesi (Almanya) Komitesi (IACUC) kullanın.

Bölüm 1: yumurta Kuluçka

  1. Döllenmiş yumurtalar 13 ° C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
  2. Yumurta, yumurta sürekli bir günde 12 kez dönen bir kuluçka makinesi, hareketli bir tepsi ile yatay yatık, 72 saat süreyle inkübe edilir. Nem 60 tutulur -% 62, 37.5 inkübasyon sıcaklığı ° C
    Not: inkübasyon, kir, tüy ve dışkı başlamadan önce dikkatli bir şekilde, oldukça yumuşak bir yüzey yapısı daha kaba bir ortak, gri zikzak el kağıt havlu, kuru silerek mekanik yumurta kabukları çıkarılır . Etanol veya dezenfektan ile yumurta silme Ancak, ne olursa olsun kullanılan sıvı embriyoların hayatta kalma oranı, önemli ölçüde azalır.

Bölüm 2: Ex-ovo kültür

  1. 72 saat inkübasyondan sonra, yumurtalar inkübatör kaldırılır.
    Not: çünkü yumurtalar 72 saat süreyle inkübe edilir, ancak bilinmeyen nedenlerle Auerbach ve al.1 önceki gelişim aşamaları ile anlaşma önemli ölçüde daha düşük sağkalım oranları vardı deneylere göre. Aşamalarında en geç 72 saat henüz CAM kapsamında değildir sarısı çuval incelir ve küçük kanamalara bağlılık alan ve (ii) yumurta sarısı-çuval rüptür (i) önde gelen yumurta kabuğu yapışma eğilimi membran. Bu nedenle sunulan yöntem 72 saatten daha büyük embriyolar için geçerli değildir.
  2. Embriyo belli bir dereceye kadar rotasyon direnir beri yumurta embriyo bulunduğu üst tarafında, kalem ile işaretlenir.
  3. Yumurtanın üstüne kalem işareti ile yatay düzenlenen ve 80 mm, yumurtanın uzun eksenine yönelik dikey döşeme bir üçgen manyetik karıştırıcı kenarında çatlak.
    Not: daha iyi bir duygu, hiç eldiven kullanılmalıdır, ancak% 70 EtOH ile eller dezenfekte edilmelidir. Yumurta kabuğu gibi yumurta zarının açılmış olduğu önemlidir. Yumurta beyazı Sızıntı yumurta zarı perfore olmuştur güvenli bir işaretidir.
  4. Yumurta, yumurta beyazı daha fazla sızmasını önlemek için Petri kabı alt yakın tutulur.
    Not: ilk açılış prosedürü sırasında, Petri kabı altındaki beyaz yumurta hala bu sonuç olarak bir vakum içinde üst embriyo sarısı tutan yumurta içinde yumurta içinde geri kalanına bağlı olduğu önemlidir. yumurta. Vakum ya yumurtanın içine hava girişi kontrol parmak basıncı ile veya bağlı yumurta beyazı yani vakum sütun artırır yumurta kaldırma düzenlenir.
  5. Hafifçe başparmak ve orta parmakları ile yumurtanın çatlak ve ekvator üzerinden çalışan meridyen basınç uygulayarak vakum düzenlenmesi mümkündür. Içerik yumurta, yumurta sarısı ile hafifçe kaldırdı ve kabuğun her iki devreyi de dikkatle ayrılır sonra hasarsız Petri çanak transfer olabilir. Embriyo ve yumurta sarısı damarları hasarsız sarısı üstüne yatırılmış olmalıdır.
    Not: kalem işareti üstünde tutulması değilse kabuk çatlama, embriyo zarar olabilir. Yumurta yeteri kadar dikkatli çatlamış veya embriyoların (bkz. yukarıda) 72 saatten daha yaşlı iseniz, sarısı çuval kabuk ve sık sık rüptürlerinin yapışıyor. Kuluçka nem% 60 veya daha düşük yumurta kuluçka sırasında döndürülmez zaman aynı olur.
  6. Ex ovo kültürlerin bir kuluçka döndü ve 37.5 ° - 38.2 ° C ve% 60 nem tutulur . Inkübatör hermetik kapalı değil (havalandırma ızgarası kısmen açık!) Ve kapak ve çanak arasındaki ayırıcılar ile özel Petri kapları kullanılır CO 2 veya O 2 kaynağı gerekli değildir.
    Not: embriyoların Hareketli inkübasyon ilk günlerinde minimum düzeyde tutulmalıdır. Yüksek mortalite oranları çok fazla ajitasyon sonuçlanır. Inkübasyon gün 9 itibaren, embriyoların ajitasyon için daha az duyarlıdır.
    Ölü embriyolar, enfeksiyonları önlemek için hemen çıkarılmalıdır.
    Hücre kültürü inkübatörler kullanılması durumunda, hermetik kapalı olan, O 2 kaynağı ölmek değil embriyolar için zorunludur. CAM kurumasına ve aşağıdaki inkübasyon sıcaklığı 37 daha düşük ise ° C, embriyoların çok yavaş gelişecektir Nem esastır.

Bölüm 3: anjiyogenez deneyleri için maddelerin uygulama

  1. Otoklavlı katlanmış filtre kağıtları (50,5 mm çapında) bir delik zımba yumrukladı ve malzeme (taşıyıcı) CAM uygulanan sıvı maddeler için destekleyici olarak kullanılır.
    Not: Neredeyse her taşıyıcı malzeme (bkz. aşağıda Tablo), gelişmekte olan CAM gemi mimari değişti, kuluçka 10 gün önce uygulanır özellikle, CAM tahriş olmasına neden oldu . Bu hidroksietil selüloz folyo gibi potansiyel atıl maddeler de dahil olmak üzere, süngerler Teflon (PTFE-pledgets), kollajen süngerler, kollajen folyo, steril gazlı bez (pamuklu çubuklar), yuvarlak kapak fişleri, ve silikon halkaları, tüm yalancı pozitif sonuç neden oldu. Filtre kağıdı en az tahrişe neden görünüyordu ve bu nedenle deneylerde kullanıldı.
  2. CAM tam gelişmiş, 6 adede kadar farklı örnekleri uygulanan olabilir ve bunların etkilerini tek bir CAM mukayese edilebilir.
  3. Filtreleri ek doz (3 mg yerli angiotropin) ya da tampon (5 ul PBS) kurutma önlemek için her gün yeniden uygulanmalıdır.
  4. Kontrolleri çevreleyen kan damarlarının desen değişmeden ise uygulamadan sonra 3 gün, kan damarları, filtreler anjiyogenik maddelere karşı yolunuzu.
    Not: CAM sarısı-çuval için yanlış olmamalıdır. CAM sarısı çuval gelişimi sırasında küçük sapmaların statik ise dinamik bir gelişmekte olan bir yapıdır. Gelişmekte olan günde üç gelişmekte CAM embriyonun kaudal sonunda küçük bir vezikül olarak ilk kez kabul edilebilir. Günde üç ve on gün arasında giderek artan bir oranda sarısı çuval overgrowing katlanmış iki katmanlı bir zar oluşturarak, ilk vezikül genişletir. Uygulama yeri iletilen ışık efektleri aksi halde embriyo mikroskobik gözlem engel olarak embriyo ve CAM (sınır) kat arasında yarım olmalıdır. Alternatif olarak, CAM büyümeye devam ediyor anjiyogenik madde ile filtre içselleştirilmiş.

Bölüm 4: CAM üzerine hücre Aşılama

Hücre, 4.1.Preparation

  1. Konfluent hücrelerin kullanımı ile steril 25 ml plastik pipet pipet yardımı ile bir kültür şişelerinde FALCON tüplerine transfer edilir.
  2. Hücre sayısını tahmin etmek için, hücre süspansiyonu 15 ul Neubauer odasına aktarılır ve hücreler mikroskop altında elle sayılır.
  3. Falcon tüpler oda sıcaklığında 1000 rpm'de 3 dakika santrifüj ve süpernatantı atılır.
  4. Üreticilerin protokole göre, örneğin PKH26 (Sigma), kırmızı floresan bir canlı hücre zarı etiketleme kiti ile boyandı canlı hücre izleme için, hücreler PBS ile istenen konsantrasyona (2x10 7 hücre / ml) seyreltilir.
    Enjeksiyon için istenilen konsantrasyon (10 7 hücre / ml) ya da aşılama (3x10 6 hücre / ml); Hücreler hücre kültürü orta (tercihen DMEM Dulbecco'nun modifiye kartal orta) yeniden askıya alınır. Zaten edebiyat 15-17 ve tecrübemizi yayınlanan yoğunluklarına göre farklı hücre konsantrasyonları enjeksiyonları karşı aşılama için uygulanır.

4.2 CAM üzerine hücrelerinin Aşılama

  1. Yüzükler (~ 1mm kalınlığında) keskin bir neşter bir 1ml pipet ya da periferik venöz kateter (PVL) tüp kesme ve E6-E14 civciv embriyo kültür ex ovo CAM uygulanır.
    Not: birkaç kez "gördüm" için çalışın ancak bir pipet veya kateter tüp yoluyla kesmek için ortaya çıkan yüzük keskin kenarlardan kaçınmak için, yeni çok keskin bir neşter kullanılarak kesilmiş . Mikroskop altında mikro çatlaklardan kaynaklanan keskin kenarlar için halkaları kontrol edin.
  2. 3x10 6 hücre / ml hücreler 20 ul halkalar boyutuna bağlı olarak bir halka içine ya da birden fazla yüzük bölünmüş birimler olarak toplam pipetlenir .
    Not: Bazı durumlarda, nazik kazıma tarafından CAM travmatize hücreleri 17 ve greft capillarisation (aşağıya bakın) aşılama kolaylaştırmak için bir ön koşul, örneğin . Bununla birlikte, CAM travmatize tasarlanmamıştır ya da tümör hücrelerinin invaziv potansiyeli çalışmaları için, örneğin contraindicative, yüzük aşılama için kullanılmamalıdır olmamalı, ancak hücreleri doğrudan halkalar veya yüzük uygulama olarak uygulanmalıdır kendilerini mikro lezyon neden olabilir . Yüzük kullanılması halinde, bu ağırlığı en aza indirmek ve CAM girinti önlemek için mümkün olduğunca ince kesilmelidir.

Bölüm 5: hücre intravitreal enjeksiyon

  1. Hamilton mikrolitrelik şırınga steril PBS sonunda% 70 EtOH ve birkaç kez durulanır.
  2. Mikro şırınga hazırlanan lekeli ya da boyasız hücre süspansiyonu (bkz. Bölüm 4.1) ile doldurulur.
    Not: enjeksiyon yerinde iğne ile penetrasyon üzerinde dikkatle embriyo (brain!) CAM veya komşu yapılara kan damarlarının zarar değil, seçilecek. Enjeksiyon diseksiyonu binoküler altında yapılmalıdır.
  3. Mikroskop kontrolü altında, Dikkatli, fakat hızlı bir şırınga iğnesi ile CAM ve göz katmanları nüfuz ve sürekli maksimum 20 ul hücre süspansiyonu (tercihen PBS içinde seyreltilmesi) civciv embriyo kültür ex ovo Vitreusa 10 enjekte.
    Not: CAM iğne ile nüfuz mümkün değilse, bu iki forseps ile yavaşça onu parçalamasını, az veya hiç kan damarları ile bir yerinde kaldırılmış olabilir .
  4. Iğne enjekte edilen hücre süspansiyonu bir sızıntı kaybını önlemek için, göz içine 1-2 saniye kalmalıdır.

Bölüm 6: tavuk bacak tomurcukları Diseksiyon

  1. Yumurta inkübatör kaldırılır inkübasyon 3 ila 4 gün sonra (E3/E4 = Hamburger Hamilton (HH) stage18-23)
  2. Yumurta, üçgen bir manyetik karıştırıcı kenarı kırık ve Petri kabı (detaylar: Bölüm 2) aktarılır ve embriyo yaylı makas kullanılarak bir daire keserek bağlı sarısı damarlarından disseke edilir.
  3. , Soğuk, steril PBS ile küçük bir tahliye kaşık kullanımı ile dolu bir taze Petri kabı embriyo transfer ve tür ajitasyon ile yıkanır.
  4. Embriyo dikkatle ince forseps ile onları parçalamasını, steril PBS ile dolu ve çevresindeki membranlar kurtulmuş küçük bir Petri kabı aktarılır.
  5. Ekstremite tomurcukları, mümkün olduğunca vücuda yakın mikrocerrahi forseps ile müstakil kavradı ve 8-10-gün eski bir konak tavuk kültürlü ex ovo (prosedürü aşılama) CAM aktarılır.

Bölüm 7: fare bacak tomurcukları hazırlanması

  1. Zaman hamile çiftleşmelerin kadar vajinal fiş kadın çiftleşme tespit edildiği günün sabah ve gebeliğin gün 0 belirlenmiş.
  2. Hamile kadın, embriyo gelişimi, (E) 10 13 embriyonik gün ulaştı ve bir balmumu kurulu sabit servikal dislokasyon ile sakrifiye.
  3. Karın duvarı orta hat boyunca kesilir ve cilt flepleri pimleri ile yanal sabit% 70 ETOH ile ıslatılır.
  4. Soğuk PBS ile müstakil ve bir behere aktarılır karın, rahmin iki boynuz kaldırılır.
  5. Embriyolar, ayrılmış bir Petri kabı ve rahim duvarına aktarılır ve embriyonik membranlar forseps kullanımı dikkatle kaldırılır.
  6. Ekstremite tomurcukları yaylı makas kullanılarak kesilmiş veya ince pens ile mümkün olduğunca vücuda yakın müstakil kavradı ve CAM transfer 8-10-günlük eski konak tavuk kültürlü ex ovo (aşılama işlemi bakınız).

Bölüm 8: tümör örneklerinin toplanması

  1. Tümör biyopsileri tümör hücre belirli bir kültür ortamı ile dolu 2 ml Eppendorf tüpleri (burada: Leibovitz orta) toplanır ve oda sıcaklığında bekletilir.
  2. Tümör biyopsileri steril neşter 1-2 mm3 parçalar halinde kesilir.
    Not: tümör örnekleri çok küçük olsaydı, onlar çok büyük olsaydı, onlar, CAM eklemek olmayabilir, CAM yaralı olabilir ve embriyo ölmek olabilir .
  3. Biyopsi örneği temel bir parçası CAM üzerine aşılı 8-10-günlük eski ev sahibi tavuk kültürlü ex ovo prosedür aşılama.
    Not: biyopsi yüzeyinden malzeme almak kas veya bağ dokusu ile kontaminasyon riski artar.

Bölüm 9: Aşılama prosedürü

  1. Bacak tomurcukları veya tümör örneklerinin, 8-10-gün eski civciv embriyosunda kültürlü ex ovo kullanılır. Tam gelişmiş CAM grefti.
  2. Greft ideal bir kan damarı Y çatallanma yakın CAM yerleştirilir.
  3. Istediğiniz uygulamayı yerinde, CAM seçici, bazal tabaka olduğu gibi bırakarak, nazik kazıma kapalı (forseps) çift epitel tabakası üst peridermal parçası travmatize.
    Not: kanama ya da kılcal damarların görünür rüptürü önlemek için çok önemlidir.
  4. Greft minimal PBS bağlı CAM aktarılır. Greft bağlı olarak, bir veya iki kez aşılama herhangi bir final aşırı PBS kaldırmak için tasarlanmıştır ve sonra nihayet hazırlanan travmatize CAM yerinde aşılı CAM, bir sitede yerleştirilmiş olabilir.
  5. Greft ince pens ile kavradı ve CAM üzerine katmanlı. Greft hassasiyetine bağlı olarak, hafif bir basınç (tümör örnekler için uygun) CAM girinti içine manevra greft (bacak tomurcukları için uygun değildir) uygulanan olabilir.
    Not: ana civciv embriyosunda sık ölecek gibi embriyonik gün (E) 18 civciv bağışıklık sistemini geliştirir, ex ovo xenografts kültürler E17 ötesinde uzatılabilir olmamalıdır.
    Seçtiğiniz donör doku kaynağı ile aynı zamana denk sırasıyla ev sahipliği CAM'lar, civciv embriyosunda kültürlü ex ovo olması önemlidir.

Bölüm 10: Re-greft

  1. Ana civciv embriyo dekapitasyon tarafından öldürülür.
  2. Ile CAMekli greft sivri makas ile dairesel bir kesim tarafından kaldırılır ve PBS ile dolu bir Petri kabı aktarılır.
  3. Aşırı CAM eski eki sitesi dışında yaylı makas greft kesilir.
  4. Daha büyük tümör örneklerinin durumda greft yarısı ya da birkaç küçük parçalara kesilir ve ikinci konak yeni CAM bakan kesme kenarı ile yeniden aşılı.

Bölüm 11: Temsilcilik Sonuçlar

Şekil 1
Şekil 1. Shell-daha az tavuk kültür
Petri kutularına farklı gelişim aşamaları kültürlü ex ovo Chicken embriyolar.

Şekil 2
Şekil 2 Ex-ovo CAM anjiyogenez tahlil
Döllenmiş tavuk yumurtası 37 ° yatay inkübe ° C ve nem 60 -% 62 ve embriyonik gün 4 (E4) Petri kapları içine kırık. Kuluçka aynı koşullar altında devam etti. CAM üstüne E10 steril filtre kağıtları (çapı 5.5 mm) az katlı ve 5 ul PBS veya 3 mg angiotropin6 yerli ya batırılmış. Kılcal damarların E14 angiotropin ıslatılmış filtre kağıdı doğru belirgin uyum gösterdi.

Şekil 3
Şekil 3 bacak tomurcukları grefti Ex ovo
Civciv (E3/E4) ve fare (E13) Ekstremite tomurcukları kabuk az tavuk kültürlerin CAM üzerine aşılanmıştır. CAM Kan damarları, iki gün sonra bacak tomurcukları girdi. Bacak tomurcukları gelişme bu ex ovo kültür civciv iki falanks sahne ulaşan ve fare bacak tomurcukları interdijital ağları azaltılması devam etti.

Şekil 4
Şekil 4 tümör örnek ex ovo aşılama
Mesane kanseri, biyopsi örneği 10 günlük civciv embriyo kültür ex ovo CAM üzerine ekildi. Kültür iki gün sonra, tümör örnek CAM damarsal bağlı olduğu ve 7 gün sonra, greft giren birden fazla kan damarları gözlenmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yenilikçi ya da sadece başka bir civciv kültür protokolü?

Eski kabuk kültür protokolleri ile civciv embriyo 1-4 toplam sağkalım oranları, örneğin ca düşüktü. % 30 1. Bu video makalede açıklanan rafine ex ovo kültür protokolü aksine,% 50'nin üzerinde sağkalım oranları sağlar. Civciv embriyo ovo kültürlerin klasik karşılaştırıldığında ex ovo kültürü CAM ve civciv embriyo erişilebilirliğini önemli ölçüde kolaylaştırır ve deneysel manipülasyon ve sürekli izleme sağlar . Bu kültür yöntemi, civciv embriyo göz 7-9 vitreus, intravasation testleri 10-12 kolaylaştırdı enjeksiyonları gelişmiş anjiyogenez deneyleri 5,6 arasında değişen çok geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılan greft ve bacak tomurcukları 13 büyüme geliştirilmiş olabilir tümör örnekleri 14 ve yenilikçi bir bakım. Böylece, ex ovo kültürü, gelişimsel, angionesis ve tümör araştırma yararlı bir araç katkıda bulunur .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yazarlar cömertçe tümör malzeme temini için mükemmel teknik destek ve Prof. Ruebben J. Kueper ve J. Wittschier teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Fertilized Eggs Animal Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Mice Animal Charles River Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray Tools Siemens AG 9503 Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160 Tools Grumbach, Germany 8101 Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS Reagent Sigma-Aldrich PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium Reagent Sigma-Aldrich D 6429 DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium Reagent Invitrogen 31415-029 here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium Reagent Sigma-Aldrich each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium
supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH Reagent Sigma-Aldrich
Magnetic stir bar, triangled 80 mm Tool VWR international 442-0391 A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5 Tool Fine Science Tools 11252-30 bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7 Tool Fine Science Tools 11271-30 curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm Tool Fine Science Tools 15000-00 fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight Tool Fine Science Tools 14094-11 Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt Tool Fine Science Tools 14007-14 Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl Tool Hamilton Co 80222 Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm) Tool Fine Science Tools 18073-15 Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels Tool Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon Tool Geuder 15758 Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins Tool Home made Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm Tool Greiner Bio-One 628102
Petri dishes 92 x 16 mm Tool Sarstedt Ltd 82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm Tool Greiner Bio-One 664160 extra deep, with spacers for ventilation
Beaker Tool 300-600 ml
FALCON tubes Tool Falcon BD 15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes Tool Eppendorf 1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips Tool Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL) Tool Viggo® Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips Tool Eppendorf
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter Tool Schleicher Schuell 311643 Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm Tool santec-medical REF 277, LOT 832/511-1 Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 Reagent Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF Reagent BASF S30200 mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura Tool Baxter Internationl Inc. REF B2246000999999 Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm Tool Assistent Germany 1001/0011 Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge Tool Wyeth Animal Health Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane Tool Resorba Woundcare Germany LOT 280303 Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs Tool Fink Walter GmbH REF 328132 Carrier; caused false positive results

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
  2. Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
  3. Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
  4. Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
  5. Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and "tube formation" but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
  6. Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
  7. Kistler, H. B. J. r., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
  8. Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
  9. Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
  10. Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
  11. Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. (2008).
  12. Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
  13. Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4, (3), 881-883 (1978).
  14. Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts' circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
  15. McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Cancer Research. 37, 1003-1010 (1977).
  16. Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Cancer Research. 65, 10959-10969 (2005).
  17. Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
Civciv<em> Ex ovo</em> Kültür ve<em> Ex ovo</em> CAM Testi: Gerçekten Nasıl Çalışır?
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).More

Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter