Summary
Protein transduktion möjliggör direkt leverans av biologiskt aktiva proteiner i celler. I motsats till konventionella metoder såsom DNA transfektion eller viral transduktion denna icke-invasiv paradigmet tillåter mycket effektiva cellulära manipulation i en titrerbar sätt kringgå cellulär toxicitet och risken för onkogena förvandling genom permanenta genetisk modifiering.
Abstract
Proteinet transduktion Tekniken gör det möjligt att direkt leverans av biologiskt aktiva material in i däggdjursceller [för granskning se 1,2]. För detta kan man använda sig av translocating förmåga så kallad cell penetrerande peptider (CPP), som även utsetts domäner protein transduktion (PTDs). TAT-CPP härrör från humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) Tat (trans-aktivator av transkription) protein har i stor utsträckning. Den positivt laddade TAT främjar cell permeabilitet så vis komma över de barriärer av cellulära membran genom endocytos och / eller direkt membran penetration 2. I kombination med en nukleär lokalisering signal (LMV) fusionsproteiner kan komma in i kärnan uppvisar funktionalitet. Vår videopresentation visar, som en exemplifiering för verkstadsindustrin av cell-genomsläppliga proteiner, konstruktion, produktion och tillämpning av en cell-genomsläppliga version av den DNA-modifiera enzymet Cre.
Cre är en platsspecifik recombinase som kan känna igen och kombinera 34 bas webbplatser par loxP i däggdjursceller in vitro och in vivo. Därför Cre / loxP-systemet används ofta för att villkorligt framkalla mutationer i genomet hos levande celler 3,4. Leveransen av aktiva Cre recombinase till celler, utgör dock en begränsning.
Vi beskriver pSESAME vektor system, vilket möjliggör en direkt att genen-av-intresse och ger en plattform för att snabbt klona olika domäner och taggar används inom vektor på ett bekvämt och standardiserat sätt. Ordna de olika taggarna har visat att ändra biokemiska egenskaper fusionsproteiner ger en möjlighet att uppnå högre avkastning och bättre löslighet. Vi visar hur uttrycka och rena rekombinanta cell-permeant proteiner i och från E. coli. Funktionaliteten av rekombinanta Cre proteinet lagfästas i cellkultur genom att bedöma dess intracellulära recombinase aktivitet.
Protocol
Konstruktion av uttryck vektor och uttryck:
Den pSESAME-Cre uttryck vektor byggdes genom att sätta in en Cre-kodning fragment i pSESAME via AvrII och NheI begränsning webbplatser med hjälp av vanliga kloning metoder. pSESAME kodar för ett fusionsprotein som består av en histidin-tagg, TAT-domän, NLS sekvens och Cre, förkortat HTNCre. För uttryck HTNCre de pSESAME-Cre förvandlades till TUNER (DE3) pLacI och används för att förbereda en glycerol lager.
- En över natten kulturen var inokuleras med en pipettspetsen belagd med förvandlade bakterier från glycerol lager. Den över-natten kultur utgjordes av LB media kompletteras med 0,5% glukos [v / v] och Carbenicillin till en slutlig koncentration av 50 mikrogram / ml och tilläts växa vid 37 ° C i 16 timmar.
- Nästa dag tätbevuxna över natten kulturen användes för att ympa uttrycket kulturen i förhållandet 1 till 40 och lades i en inkubator vid 37 ° C. Uttryck kultur bestod av TB media kompletteras med 0,5% glukos [v / v] och ampicillin till en slutlig koncentration av 100 mikrogram / ml.
- Vid en OD 595 på 1,5 uttrycket kulturen inducerade med 0,5 mM IPTG, 1 h.
- Därefter bakterier samlades in genom centrifugering vid 5000 rpm i 10 minuter i en SLA3000 rotorn.
- Bakterier pellets förvarades vid minus 20 ° C tills rening.
Rening av cell-genomsläppliga protein:
- Frysta bakterier pellets var suspenderade i 10 ml lyseringsbuffert per liter kolv kultur i 15 minuter i rumstemperatur.
- Fjädring var inkuberas sedan med 1 mg / ml lysozym för ytterligare 15 minuter under omrörning i rumstemperatur.
- 25 U / mL bensonas lades efteråt och inkuberas under omrörning i 15 minuter i rumstemperatur.
- Efter sonification på is för 1,5 min med 0,5 s pulser på 45% av makten, per ml 1 ml kallt vinsyra salt buffert (TSB) suspension har omsorgsfullt lagts under omrörning och inkuberas i 5 minuter på is. SDS-PAGE urval av lysat fraktion (L) togs.
- Cleared lysat erhölls genom centrifugering vid 4 ° C i 30 min vid 30 tusen g. SDS-PAGE prover av lösliga (S) och olösliga fraktioner (I) togs.
- Supernatanten överfördes till frisk 50 ml Falcon rör och var sedan försiktigt blandas i 1 h vid 4 ° C med 2 ml 50% Ni-NTA slam per liter inledande uttryck kultur.
- Suspensionen packades in i en självfall EconoPac kolumn (SDS-PAGE urval av genomströmning fraktion (FT) tagit var) och tvättas två gånger med 5 säng-volymer av tvätt buffert. SDS-PAGE prover av både tvätt fraktioner (W1 och W2) samlades in.
- HTNCre-innehållande fraktioner var elueras med 3 bed-volymer eluering buffert och prov av eluatet fraktion (E) för SDS-PAGE analys togs.
- Imidazol togs bort av dialyzing eluering bråkdel mot höga saltbuffert två gånger.
- Proteinet Lösningen blev ytterligare koncentreras genom dialyzing mot glycerol buffert två gånger. I alla dialys steg förhållandet mellan buffert för urvalet var minst 50. Detta förfarande resulterade i en glycerol stamlösning innehåller HTNCre på en vanlig koncentration mellan 200 och 450 mikroM, så att exempelvis 1 liter uttryck kultur resulterar i ~ 12 mg protein. Exempel på glycerol lager (GS) för SDS-PAGE analys samlades in. HTNCre stamlösning kan förvaras vid minus 20 ° C.
Figur 1: SDS-PAGE analys av prover som samlats in under reningsprocessen av Cre recombinase. Induktion av Cre uttryck indikeras av dominerande band i lysat fraktion. Även om en del av proteinet är olösliga i Cre protein kan ytterligare berikas som sett i eluatet och glycerol fraktioner lager. L: lysat, I: Olöslig, S: supernatanten FT: genomströmning, W: Tvätt, E: eluatet, GS: Gylcerol Stock. Vänligen klicka här för att se en större version av figur 1.
Protein transduktion i murina embryonala stamceller (ES-celler):
- ES-celler bär en villkorlig β-galaktosidas reporter 5 uppföra var seedade som enskilda celler med TrypLE ™ Express för dissociation av anhängare celler. Efter 4 till 6 timmar cellerna hade re-anslutna och mediet togs bort.
- Därefter ES-celler inkuberades med HTNCre-innehållande medium för 16 timmar.
- En lämplig mängd HTNCre protein (motsvarande 10 M) ut ur glycerol lagret späddes i ES medium och därefter sterilt filtrerad (0,22 mikrometer).
- Efter protein transduktion medelstora byttes tillbaka till normal tillväxt medium.
- Efter två dagar cellerna tvättas med PBS och fixeras med 4% Paraformaldehyd (PFA) i 10 minuter.
- Två ytterligaretionella tvätt steg med PBS avrättades innan X-Gal färgning utfördes.
- Fast celler var täckta med ett lager av X-Gal färglösningen 6 och inkuberas över natten vid 37 ° C.
Representativa resultat:
Nästa dag X-Gal färglösningen var strävade och cellerna var täckta med ett lager av PBS för mikroskopi analys. 80 och 100% av modifierat cellerna kunde observeras i murina ES-celler bedöms av β-galaktosidas aktivitet.
Discussion
Under reningsprocessen av Cre fusionsproteinet är det viktigt att inte utelämna tillägg av iskall TBS buffert före centrifugering. Annars Cre recombinase tenderar att fälla i glycerol buffert.
Om eluatet bråkdel verkar bli grumligt på grund av den höga koncentrationen av fusionsprotein ytterligare elueringen buffert bör läggas förrän lösningen har rensat igen.
Tillämpningen av 10 mikrometer i Cre fusionsprotein resulterar normalt i en rekombination verkningsgrad på 80 till 100%. Fetalt kalvserum (FCS) är en viktig komponent i ES-celler medelstora starkt hämmar proteinsyntesen transduktion. Därför är hög koncentration av Cre recombinase måste användas. När du arbetar i serum-fria förhållanden mindre protein (0,5 - 2 ìm) kan användas för att uppnå liknande rekombination effektivitet.
Med pSESAME vektorsystem till hands kan man använda tekniken av protein transduktion till andra proteiner, inklusive transkriptionsfaktorer som Oct4 och Sox2 7 och Scl/Tal1 8.
Acknowledgments
Vi tackar Oliver Brüstle och alla medlemmar av Stem Cell Engineering Group, universitetet i Bonn, för stöd och värdefulla diskussioner. Vi tackar Sabine Schenk för beredning av SDS-PAGE och bestående stöd under hela projektet. Nicole Russ och Anna Magerhans som utmärkt teknisk support. Dessutom vill vi tacka Andreas Bar och Sheila Mertens för produktionen av filmen. Detta arbete har finansierats med bidrag från Volkswagen Foundation (Az I/77864) och det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF, 01 GN 0813).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TUNER (DE3) pLacI | Novagen, EMD Millipore | 70625 | |
| Glycerol | Carl Roth GmbH | 3783.2 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth Gmbh | T876.1 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| HCl | Carl Roth Gmbh | 4625.1 | |
| Imidazol | Carl Roth Gmbh | X998.4 | |
| NaCl | Carl Roth Gmbh | 9265.2 | |
| Yeast Extract | Carl Roth Gmbh | 2363.4 | |
| Trypton/Pepton | Carl Roth Gmbh | 8952.4 | |
| K2HPO4 | Carl Roth Gmbh | P749.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth Gmbh | 3904.1 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Carbenicillin | Sigma-Aldrich | 6344.2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Benzonase | Novagen, EMD Millipore | ||
| L-Tartaric acid, disodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| 50% Ni-NTA slurry | Invitrogen | R901-15 | |
| EconoPac columns | Bio-Rad | 732-1010 | |
| Sterile filter 0,22μm | Whatman, GE Healthcare | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | ||
| LB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl | ||
| TB medium | Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4 | ||
| Lysis Buffer | 50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8 | ||
| Tartaric Salt Buffer (TSB) | PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol | ||
| Washing Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol | ||
| Elution Buffer | PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol | ||
| High Salt Buffer | 600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | ||
| Gylcerol Buffer | 50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 | ||
| TrypLE™ Express | Invitrogen | ||
| ESGRO (LIF) | EMD Millipore | ||
| NEAA | GIBCO, by Life Technologies | 11140035 | |
| L-Glutamin | GIBCO, by Life Technologies | 25030024 | |
| β-Mercapt–thanol | GIBCO, by Life Technologies | 31350010 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960044 | |
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | ||
| X-Gal staining solution: | 4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS |
||
| K3(FeIII(CN)6) | Sigma-Aldrich | P-3367 | |
| K4 (FeII(CN)6) | Sigma-Aldrich | P-9387 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| X-Gal | Sigma-Aldrich | B4252 |
References
- Gump, J. M., Dowdy, S. F. TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects. Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).
- Edenhofer, F. Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins. Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).
- Branda, C. S., Dymecki, S. M. Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice. Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).
- Nolden, L. Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase. Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).
- Zhang, Y. Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).
- Peitz, M. Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells. Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).
- Bosnali, M., Edenhofer, F. Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2. Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).
- Landry, J. R. Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver. Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).
