Summary
Hier zeigen wir, wie retro-orbitalen Injektion bei erwachsenen Zebrafisch zu tun.
Abstract
Die medikamentöse Behandlung von ganzen Tieren ist ein wichtiges Instrument in jedem Modell für pharmakologische und chemische genetische Studien. Die intravenöse (iv) Injektion ist oft das wirksamste und nicht-invasive Form der Lieferung eines Agenten von Interesse. In der Zebrafisch (
Protocol
Teil 1. Vorbereitung von Injektionsmaterial
- Tg (Globin: GFP)-Zellen:
- Bleed erwachsenen Spenders Fisch mit 10ul Pipettenspitze in Heparin (1unit/ul) zu punktieren Fisch hinter gill beschichtet.
- Absaugen roten Blutkörperchen und verzichten in der Zelle Puffer (0.9X PBS + 5% FBS + 1% Pen / Strep).
- Filter Zellsuspension über 40um Mesh und bestimmen Konzentration von Zellen mit Hämozytometer wie zuvor von LeBlanc et al.
- Spin nach unten und resuspendieren in Zell-Puffer bei gewünschten Konzentration, so dass endgültige Injektionsvolumen nicht mehr als 5UL. Hier injizieren wir 1,5 bis 2.000.000 Zellen / Empfänger.
- Für die Dextran, Texas Red ®, löst den Farbstoff in DPBS für einen letzten Injektion Konzentration von 10-12 mg / mL. Planen bis 4 uL pro Fisch zu injizieren.
Part 2. Injektion
- Anesthetize Fisch in Tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml Fisch Wasser).
- Wash Hamilton-Spritze 3-4 mal vor der Injektion mit 70% Ethanol. Spülen Sie 3-4 mal mit 0.9X DPBS.
- Legen Sie den Fisch Rückenseite nach oben und nach rechts auf feuchten Schwamm entfernen.
- Halten Sie die Hamilton-Spritze mit der rechten Hand und mit dem Zeigefinger auf den Kolben. Gently stabilisieren den Körper des Fisches mit der linken Hand.
- Positionieren Sie die Nadel mit der Fase nach oben, so dass, wenn die Fische s Auge waren eine Uhr, die Nadel am 07.00 Position und in einem 45 Grad Winkel zum Fisch (Abb. 1) zeigt.
- Schieben Sie Nadel 1-2 mm in 7.00 Position und langsam drücken Sie den Kolben.
- Lassen Sie die Fische in frischen E3 Wasser erholen.
- Wash Nadel, wie oben, zwischen den Injektionen von verschiedenen Reagenzien beschrieben.
- Flick Zelle Lösung für die Zellen alle paar Minuten zu Zelle Verklumpen zu verhindern.
- Keep Fisch off flow für 1 Woche mit täglichen Wasserwechsel um Infektionen zu vermeiden. Wir halten Fisch im Wasser ICU für diesen Zeitraum (10 mL Stress-Mantel + 5 ml pemafix + 5 ml melafix pro 38 Liter Wasser E3).
Teil 3. Repräsentative Ergebnisse
Wenn richtig ausgeführt, ist es möglich, injizierten Materials sichtbar, wenn sie in irgendeiner Weise gekennzeichnet. Zum Beispiel, Tg (Globin: GFP) sollten roten Blutkörperchen unter einem Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop Umlauf in das Gefäßsystem des Empfängers casper Fisch kurz nach der Injektion, wie in Abbildung 2 ersichtlich. Ebenso kann die Injektion eines 70 kDa Dextran, konjugiert mit Texas Red ® visualisiert werden in das Gefäßsystem des durchsichtiger Fisch unmittelbar nach retroorbitalen Injektion (Abbildung 3). Fluorescent Nierenzellen von Tg (β-Aktin: GFP) Spender Fisch kann auch retroorbital in bestrahlte casper Empfänger Fisch injiziert werden. Diese Zellen werden schließlich zu Hause an den Empfänger Knochenmark (Abb. 4a) und kann dann weiter auf die Niere nach einigen Wochen (Bild 4b) neu zu besiedeln.
Wenn die Injektion zu flach ist oder der Winkel der Nadel umgeht die retro-orbitalen venösen Kieferhöhle kann injizierten Materials sichtbar gemacht werden Pooling um das Auge oder fließenden aus ihm heraus. Alternativ, wenn die Injektion zu tief ist, kann Fische Erfahrung Gewebeschädigung oder starke Blutungen, obwohl sie vielleicht noch erholen. Wenn richtig ausgeführt, sollte die Mortalität nach retroorbitalen Injektion weniger als 5% der gesamten injizierten Fischen und den Erfolg der Auslieferung an den Blutkreislauf sollte größer als 90% der gesamten injizierten Fische.
Abbildung 1: Illustration des retro-orbitalen Injektionstechnik. Das rechte Auge des Fisches wird als eine analoge Uhr, in der die 07 Uhr-Position entspricht der richtigen Injektionstechnik vor Ort vertreten.
Abbildung 2: Tg (Globin: GFP) roten Blutkörperchen, die in der Gefäßversorgung des Schwanzes eines Erwachsenen casper Fisches drei Tage nach retroorbitalen Injektion.
Abbildung 3: Erfolgreiche Injektion eines 70 kDa Dextran konjugiert Texas Red ® als Farbstoff produziert fluoreszierende Gefäßsystem in das transparente erwachsenen Fischen, casper und ist leicht mit Standard angesehen ganze Tier Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt.
Abbildung 4a: Drei Tage nach der retro-orbitalen Injektion gesamte Niere Knochenmarkzellen von Tg (β-Aktin: GFP) Spender Fische, die Zellen visualisiert werden können Homing der Niere Knochenmark der bestrahlten erwachsenen casper Empfänger Fisch.
Abbildung4b: Vier Wochen nach der retro-orbitalen Injektion gesamte Niere Knochenmarkzellen von Tg (β-Aktin: GFP) Spender Fisch, der Wiederbesiedlung des Empfängers Niere mit grünen Spender gesamte Niere Knochenmarkzellen werden in bestrahlten erwachsenen casper Empfänger Fisch visualisiert.
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Discussion
Retro-Orbital-Injektion bei erwachsenen Zebrafisch gibt die höchste Effizienz der Lieferung von injizierten Materials in die Blutbahn mit der niedrigsten Inzidenz der Mortalität. Aufgrund der Art der Einspritzung, taucht der Einstichstelle, schnell zu heilen, sinkende das Auftreten von Infektionen und Menge des Blutverlustes. Die Website kann auch wiederholt während einer kurzen Zeit für die tägliche Injektionen von Drogen injiziert werden, zum Beispiel.
Große Mengen von Drogen ist für die traditionellen Behandlungsmethoden bei erwachsenen Fische in dem die Fische einfach eingetaucht werden und in Wasser eingeweicht, die das Medikament von Interesse erworben werden. Allerdings, wenn das Medikament direkt in den Blutkreislauf des Tieres injiziert wird, ist eine viel kleinere Menge für die Behandlung erforderlich, wodurch abnehmender experimentellen Kosten. Für bestimmte Verbindungen, die zu groß, um die Fische Zirkulation durch Einweichen, im Falle bestimmter Peptide geben sind, kann retro-orbitale Injektion auch von Vorteil sein.
Da ferner RO Injektion ist schneller und einfacher als intrakardiale Injektion Techniken in der erwachsenen Fische, kann eine weitere Anwendung der RO Injektion sind erwachsene chemisch-genetischen Screening. So kann retroorbitalen Injektion erheblich erleichtern Zebrafisch Forschung, die die chemische oder chemische Lieferung.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wird von Howard Hughes Medical Institute und einen Zuschuss von der NIH für das Studium der embryonalen Blutbildung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
