Summary
Здесь мы показываем, как это сделать ретро-орбиту у взрослых рыбок данио.
Abstract
Медикаментозное лечение целых животных является важным инструментом в любой модели системы для фармакологической и химической генетических исследований. Внутривенно (IV) инъекции часто является наиболее эффективным и неинвазивной формой доставки агентов, представляющих интерес. В данио (
Protocol
Часть 1. Подготовка материала инъекции
- Tg (глобина: GFP) клеток:
- Bleed взрослых рыб доноров использованием 10ul кончиком пипетки покрытие гепарином (1unit/ul), чтобы проколоть рыбу за жабры.
- Аспирируйте красных кровяных клеток и обойтись в ячейке буфера (PBS 0.9x + 5% ЭТС + 1% Pen / Strep).
- Фильтры суспензии клеток за 40uM сетки и определения концентрации клеток с использованием гемоцитометра, как описано выше по Лебланк и соавт.
- Спином вниз и ресуспендируют в ячейке буфера при нужной концентрации, что окончательный объем инъекций составляет не более 5ul. Здесь мы вводим 1,5-2 млн. кл / получателя.
- Для декстран, Texas Red ®, растворить краситель в DPBS для конечной концентрации инъекции 10-12 мг / мл. План для введения 4 мкл на рыбу.
Часть 2. Инъекция
- Обезболить рыбы в tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml рыбы вода).
- Вымойте Гамильтон шприца 3-4 раз перед инъекцией с использованием 70% этанола. Промыть 3-4 раза с 0,9 x DPBS.
- Место рыб спинной стороной вверх и вправо на влажной губкой.
- Держите шприц Гамильтон со своей правой рукой и указательным пальцем на поршень. Аккуратно стабилизировать тело рыбы с левой рукой.
- Расположите иглу с коническими вверх, что если глаз с рыбой были часы, стрелка будет указывая на 7:00 позиции и на 45 градусов к рыбе (рис. 1).
- Осторожно введите иглу 1-2 мм в 7:00 позицию и медленно нажмите поршень.
- Разрешить рыбы для восстановления в пресной воде E3.
- Вымойте иглы, как описано выше, между инъекциями различных реагентов.
- Флик клетка решение для ресуспендирования клетки каждые несколько минут, чтобы предотвратить слипание ячейки.
- Хранить рыбу с потоком в течение 1 недели с ежедневными изменениями воды, чтобы избежать инфекции. Мы продолжаем рыба в воде ICU за этот период (10 мл Стресс пальто + 5 мл + 5 мл pemafix MelaFix на 38 литров воды E3).
Часть 3. Представитель Результаты
Когда выполнены правильно, то можно представить себе вводили материал, если он был назван в некотором роде. Например, Tg (глобина: GFP) эритроцитов следует рассматривать под флуоресцентного микроскопа рассечение, циркулирующей в сосудистой рыбы получателя Каспер вскоре после инъекции, как показано на рисунке 2. Кроме того, введение 70kDa декстран, сопряженных с Texas Red ® могут быть визуализированы в сосудистую прозрачной рыбы сразу же после ретро-орбиту (рис. 3). Флуоресцентные клетки почки от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы также может быть введен ретро-орбитально в облученной рыбы получателя Каспер. Эти клетки в конечном итоге домой к получателю мозга (рис. 4а), а затем может перейти к населить почек после нескольких недель (рис. 4б).
Если инъекция слишком мелко или угол иглы обходит ретроорбитального венозных синусов полости, вводимый материал может быть визуализированы объединения вокруг глаз или вытекающих из него. Кроме того, если инъекция слишком глубоко, рыбы могут возникнуть повреждения тканей или чрезмерное кровотечение, хотя они все еще может восстановиться. При правильном выполнении смертности после ретро-орбиту должно быть не менее 5% от общего числа вводили рыбу и успех доставки крови должно быть больше 90% от общего числа вводили рыбу.
Рисунок 1: Иллюстрация ретро-орбиту техники. Правый глаз рыбы представляется как аналоговые часы, в которых 7:00 позиция соответствует правильном месте инъекции.
Рисунок 2: Tg (глобина: GFP) красные кровяные клетки, циркулирующие в сосудистую хвоста взрослой рыбы Каспер три дня после ретроорбитального инъекции.
Рисунок 3: Успешное введение 70kDa декстран конъюгированных с Texas Red ® используется как краситель производит люминесцентные сосудистую в прозрачном взрослых рыб, Каспер и легко просматривать с помощью стандартных целом микроскопии флуоресценции животного.
Рисунок 4а: три дня после ретро-орбиту целой почки клеток костного мозга от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы, клетки могут быть визуализированы самонаведения для почек мозга облученных рыбы Каспер получателя взрослых.
Фигура4b: четыре недели после ретро-орбиту целой почки клеток костного мозга от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы, заселение реципиента почки с зелеными доноров целые клетки мозга почек могут быть визуализированы в облученной рыбы Каспер получателя взрослых.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ретро-орбиту у взрослых данио дает наибольшую эффективность доставки вводят материал в кровоток с самой низкой частоты смертности. Из-за характера инъекции месте прокола кажется заживают быстро, уменьшая возникновения инфекции и объем кровопотери. Сайте, могут быть даже неоднократно вводили в течение короткого времени для ежедневных инъекций наркотиков, например.
Большое количество наркотиков должны быть приобретены для традиционных методов лечения у взрослых рыб, в которых рыба просто погруженным и вымачивают в воде, содержащей наркотиков, представляющих интерес. Однако, если препарат вводится непосредственно в кровь животного, гораздо меньшее количество требуется для лечения, тем самым уменьшая экспериментальных затрат. Для некоторых соединений, которые слишком велики, чтобы войти в рыбе циркуляции через замачивания, в случае определенных пептидов, ретро-орбиту также может быть выгодно.
Далее, поскольку RO инъекции быстрее и проще, чем внутрисердечных методов инъекции взрослых рыб, другого приложения РО инъекции могут включать в себя взрослой химического генетического скрининга. Таким образом, ретро-орбитальной инъекция может значительно облегчить данио исследований, требующих химической или химической доставки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке Медицинского института Говарда Хьюза и грант NIH для изучения эмбрионального кроветворения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | 2106 | Preweighed vial of 300 USP units |
| Tricaine-S | Western Chemical | MS-222 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14190-144 | |
| Dextran, Texas Red® | Molecular Probes, Life Technologies | D1830 | |
| E3 | 5mM NaCl 0.17 mM Kcl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 |
||
| Microliter Syringe | Hamilton Co | 80300 | 701N 10uL SYR (26s/2”/2) |
References
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
- Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
- White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).
